基于病證結(jié)合評價“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法的高血壓模型建立

蔣科芳 盛陽 徐露 潘旭鳴 印媛君?

基于病證結(jié)合評價“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法的高血壓模型建立

蔣科芳 盛陽 徐露 潘旭鳴 印媛君?

目的 探究“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法高血壓模型與中醫(yī)證型的符合度。方法 將32只SD大鼠隨機(jī)分為4組：空白組、高鹽飲食加灌附子湯組（中藥造模）、假手術(shù)組、“雙腎一夾”組（手術(shù)造模）。造模后21d觀察大鼠尾動脈壓、腎臟指數(shù)、行為學(xué)指標(biāo)、腎臟病理學(xué)切片，統(tǒng)計(jì)研究結(jié)果。結(jié)果 與空白組比較，中藥造模組大鼠血壓值變化有顯著性差異（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組大鼠血壓值均有顯著性差異（P＜0.01）。中藥造模組與手術(shù)造模組大鼠血壓值無明顯差異（P＞0.05）。與空白組比較，中藥造模組造模后量表評分有顯著性差異（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組大鼠造模后量表評分無明顯性差異（P＞0.05）。中藥造模組與手術(shù)造模組大鼠造模后量表評分有顯著性差異（P＜0.01）。與空白組比較，中藥造模組造模后腎臟指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組大鼠造模后腎臟指數(shù)有顯著性差異（P＜0.01）。中藥造模組與手術(shù)造模組大鼠造模后腎臟指數(shù)有明顯差異（P＜0.05）。與空白組比較，中藥造模組大鼠左腎無明顯變化。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組左側(cè)腎臟因供血不足發(fā)生明顯固縮。中藥造模組與手術(shù)造模組大鼠造模后腎臟固縮差異明顯。與空白組大鼠比較，中藥造模腎小球腎小管形態(tài)無差異；與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組腎小球萎縮。結(jié)論 “兩腎一夾”法和“高鹽飲食加灌附子湯法”均是有效的建立高血壓模型的方法，但與“兩腎一夾”法建立的高血壓模型比較，高鹽飲食加灌附子湯法的高血壓模型更符合中醫(yī)肝陽上亢證。

高血壓 模型 病證結(jié)合

高血壓是最常見的心血管疾病，中醫(yī)證型［1］有心腎氣虛﹑肝陽上亢﹑陰陽兩虛﹑痰濕壅盛﹑痰熱﹑瘀血阻絡(luò)及其他共七大類。與人類疾病吻合的高血壓模型的建立，可為中醫(yī)藥治療高血壓提供重要支撐，而中醫(yī)藥的療效又有賴于明確辨證分型的建立。“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法是目前建立高血壓動物模型經(jīng)典方法［2-4］，但兩者與中醫(yī)證型的符合度尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過比較“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法建立不同的高血壓模型，分析兩種高血壓模型與中醫(yī)證型的符合度，從而探討在病證結(jié)合時高血壓模型建立的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）藥物：附子湯（由單味制附子20g，浸泡30min，總計(jì)煎煮90min，濃縮為200ml，含生藥0.1mmol/L。購買自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬名醫(yī)館），10%水合氯醛，注射用青霉素鈉，高濃度鹽水（1.5%）。（2）動物：健康﹑雄性﹑清潔級SD大鼠，體重180～200g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號SCXK（滬）2013-2016。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周后，供試驗(yàn)使用。（3）儀器：大鼠無創(chuàng)血壓測定系統(tǒng)（上海奧爾特生物科技有限公司），動物恒溫系統(tǒng)（上海奧爾特生物科技有限公司），GX-400精密電子天平（上海勤酬實(shí)業(yè)有限公司），無菌針灸針，規(guī)格：0.25×25mm；3/0﹑4/0醫(yī)用真絲編織線（使用前均經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）術(shù)前準(zhǔn)備及動物分組：所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飼以常規(guī)固體飼料，自由飲水，在喂養(yǎng)適應(yīng)1周后方開始實(shí)驗(yàn)。將擬用于實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：空白組（n=8）﹑中藥造模組（n=8）﹑假手術(shù)組（n=8）和手術(shù)組（n=8）。（2）基礎(chǔ)血壓測定：測量環(huán)境安靜﹑恒溫（28℃），測量所有大鼠尾動脈收縮壓為基礎(chǔ)血壓。（3）模型建立：手術(shù)建模參照文獻(xiàn)［5］：用10%的水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉SD大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺上，四肢和牙齒用橡皮筋固定。用棉簽蘸脫毛劑涂抹在SD大鼠腹部，3～5min后用棉簽擦去脫下的毛和脫毛劑。5%碘伏消毒腹部，75%酒精脫碘，蓋上孔巾沿腹正中線作手術(shù)切口打開腹腔，按無菌操作，小心﹑鈍性分離出左腎動脈，然后穿入無菌絲線，將直徑為0.25mm的針灸針與腎動脈血管長軸緊貼平行放置，用無菌絲線扎緊腎動脈和針灸針，然后抽出針灸針，結(jié)果造成單側(cè)腎動脈狹窄。假手術(shù)組只打開腹腔，分離左腎動脈后關(guān)腹。術(shù)后給予2%氯化鈉水溶液，術(shù)后3d青霉素治療（3×104U/d）。中藥建模參考文獻(xiàn)［2-3］，附子湯+高濃度鹽水綜合法造模。用2g/（kg·d）附子湯灌胃大鼠，同時予高濃度鹽水（1.5%）飲水3周。造模處理后凡血壓比處理前高20mmHg（大于正常血壓3個標(biāo)準(zhǔn)差）以上且＞115mmHg者確認(rèn)為高血壓模型形成。造模過程中密切觀察大鼠行為學(xué)指標(biāo)。（4）血壓測量：造模后21d用尾套法測量大鼠血壓，重復(fù)3次取其均值。（5）行為學(xué)指標(biāo)觀察：觀察大鼠行為學(xué)指標(biāo)，主要是毛色是否光澤，雙眼結(jié)合膜顏色是否加深變紅，飲水量，體重增長情況以及易激惹程度的變化（總分≥9即模型成功）。（6）腎臟指數(shù)的測定：取右側(cè)腎臟，剝離腎膜，濾紙吸干水分，分別稱重即得右腎重量（RKW），計(jì)算右腎臟重量指數(shù)（RKW/ BW）。（7）右腎病理學(xué)觀察：取大鼠右側(cè)腎臟，取部分腎臟去除包膜，用生理鹽水沖洗，去除血液，并用濾紙拭干，部分放入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSSl7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后各組大鼠尾動脈收縮壓比較 見表1。

表1 造模前后各組大鼠尾動脈收縮壓比較［mmHg，］

表1 造模前后各組大鼠尾動脈收縮壓比較［mmHg，］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組比較，#P＜0.01

組別n造模前造模后造模前后差值空白組8122.25±10.38122.62±10.703±1.06中藥造模組8116.75±8.36172.75±5.80 *56±9.30假手術(shù)組8117.5±11.88115.5±8.56-2±4.93手術(shù)造模組8124.75±6.73174.5±6.76#49.75±8.68

2.2 造模后各組大鼠行為學(xué)量表得分比較 見表2。

表2 造模后各組大鼠行為學(xué)量表得分比較［分，］

表2 造模后各組大鼠行為學(xué)量表得分比較［分，］

注：與空白組比較，*P＜0.01

組別n造模前造模后差值空白組80.88±0.830.75±0.71-0.12±1.23中藥造模組80.375±0.529.88±0.83*9.5±0.76假手術(shù)組80.75±0.711±0.530.25±0.89手術(shù)造模組80.75±0.710.63±0.52-0.13±0.99

2.3 造模后各組大鼠腎臟指數(shù)比較 見表3。

表3 造模后各組大鼠腎臟指數(shù)比較［mg/g，］

表3 造模后各組大鼠腎臟指數(shù)比較［mg/g，］

注：與中藥造模組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，#P＜0.01

組別n體重（BW）右腎濕重（RKW）RKW/BW空白組8200.75±7.551.17±0.15.87±0.54中藥造模組8122±3.821.22±0.66.01±0.42假手術(shù)組8190.75±10.361.21±0.106.38±0.72手術(shù)造模組8181.75±7.751.33±0.11*#7.32±0.77

2.4 各左側(cè)腎固縮情況比較 腎臟固縮程度［6］分為完全固縮即腎臟全部鈣化變?yōu)榘咨徊糠止炭s即腎臟未全鈣化，部分尤其是靠近腎門部分的組織還是鮮紅色；無固縮即整個腎臟只發(fā)生縮小的變化，無鈣化發(fā)生。與空白組比較，中藥造模組大鼠左腎無明顯變化（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組左腎固縮明顯（P＜0.01）。與中藥造模組比較，手術(shù)造模組左腎固縮非常明顯（P＜0.01）（見圖1﹑2，表4）。

圖1 各組左腎形態(tài)

圖2 手術(shù)組左腎切片

表4 造模后各組大鼠左腎固縮情況（n/%）

2.5 病理結(jié)果 與空白組大鼠比較，中藥造模腎小球腎小管形態(tài)無明顯差異。與假手術(shù)組比較，手術(shù)造模組腎小球萎縮，部分腎小球代償性肥大，腎間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤等（見圖3）。

圖3 各組大鼠腎組織變化（HE×100）（A：空白組；B：中藥造模

3 討論

中醫(yī)藥在高血壓治療上有獨(dú)特優(yōu)勢，而辨證論治是其取效的關(guān)鍵與特色。因此，中醫(yī)藥研究的動物模型宜采用病證結(jié)合的方式。“兩腎一夾”法和高鹽飲食加灌附子湯法是目前建立高血壓動物模型相對成熟﹑便捷的方法。通過對比這兩種造模方法與中醫(yī)證型的吻合度，無疑是高血壓病證結(jié)合模型建立的有益探索。“兩腎一夾”法是將大鼠一側(cè)腎臟腎動脈結(jié)扎，由于結(jié)扎側(cè)腎臟缺血而造成腎素增多，腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，蓄積的腎素釋放到循環(huán)血液中，催化血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成，導(dǎo)致血壓升高［13］，而于神經(jīng)系統(tǒng)的興奮作用不明顯。所以手術(shù)造模組大鼠出現(xiàn)血壓升高；造模后因血流量減少，左腎固縮明顯，鏡下鈣化；右腎腎臟指數(shù)明顯高于假手術(shù)組，表明右腎代償性增大，且鏡下發(fā)現(xiàn)腎小球萎縮。但無明顯躁動的行為表現(xiàn)，且大鼠造模后被毛緊湊，毛色有光澤，雙眼結(jié)合膜顏色無明顯變化；飲水量無明顯變化。按篩選量表得到該組大鼠評分明顯＜9分，不符合肝陽上亢證。

中藥造模法通過高鹽飲食讓大鼠攝入過多鹽，使其體內(nèi)出現(xiàn)水鈉潴留，導(dǎo)致動脈血壓升高。同時水鈉潴留還將增加血管緊張性，促進(jìn)去甲腎上腺素的釋放，使血壓進(jìn)一步升高。附子中的去甲烏藥堿通過激動α受體，增強(qiáng)心肌收縮力和心輸出量，升高血壓。附子中多種成分能直接作用于神經(jīng)，興奮下丘腦CRH神經(jīng)細(xì)胞，引起亢奮。所以中藥造模組大鼠明顯血壓升高，出現(xiàn)提尾時尖叫﹑驚跳甚至咬人或同籠大鼠頻繁打斗等躁動現(xiàn)象，且造模后被毛蓬松，毛色漸暗，雙眼結(jié)合膜顏色加深變紅；飲水量明顯增多，消瘦明顯。該組大鼠按篩選量表評分均≥9分，符合肝陽上亢證。從中醫(yī)機(jī)理分析，因咸入腎，但咸味太過，則以喜為惡，反補(bǔ)為瀉，傷及腎陰，又因肝腎同源，腎虛日久則肝腎陰液俱虧。附子大辛大熱，過服易灼傷津液，造成肝腎陰精虧虛。陰不制陽，肝陽偏盛，出現(xiàn)一派熱甚煩躁之象。

“兩腎一夾”法作為實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)典造模方法，但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該法所得的模型雖然滿足單純高血壓病，但不滿足中醫(yī)肝陽上亢證的標(biāo)準(zhǔn)。與“兩腎一夾”法比較，高鹽飲食加灌附子湯法的高血壓模型更符合中醫(yī)肝陽上亢證，可為中醫(yī)藥治療肝陽上亢型高血壓提供重要支撐。

［1］ 張伯臾,中醫(yī)內(nèi)科學(xué)．第五版:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1985:204．

［2］ 王欽茂,李莉,趙勇,等．清化膠囊對三種因素復(fù)合制造大鼠高血壓肝陽上亢證模型的治療作用．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2002,8(3):14-17．

［3］ 謝映,肝陽上亢證與肝陽化風(fēng)證模型大鼠的UCH-L1、StAR mRNA表達(dá)的研究．中南大學(xué),2007．

［4］ 黃玲玲,俞婷婷,郭焜,等．不同內(nèi)徑銀夾誘導(dǎo)2K1C高血壓模型的比較．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2013,18(6):621-624．

［5］ 戴勇,彭武建,徐卓佳．“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠模型的改進(jìn)．實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理,2006,23(2):61-62．

［6］ 何自育,楊育紅．黃芪甲苷對兩腎一夾型腎性高血壓大鼠腎臟病變的影響．大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(1):29-30．

［7］ 胡淑平,呂圭源,于平野,等．肝陽上亢型高血壓模型及評價初探．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,32(5):699．

［8］ 陳華德．耳尖高血壓肝陽上亢證大鼠血清NO的影響．中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(5):817-819．

［9］ 何綱,李桂英,劉新波．一種高血壓腦出血肝陽上亢證大鼠模型的建立及其評價．中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2005,12(4):218-222．

［10］ 肖純,奎益強(qiáng),王勇華．雙腎雙夾加灌附子湯法復(fù)制高血壓肝陽上亢證大鼠模型．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2000,10(9):20-22．

［11］ 陳華德,方針,王翀敏．耳尖放血治療高血壓病肝陽上亢證療效觀察．中國針灸,2004,24(4):229-231．

［12］ 王娟,趙英強(qiáng),肝陽上亢型高血壓動物模型的評價方法和體系．中華中醫(yī)藥學(xué)會心病分會學(xué)術(shù)年會,2014:200-206．

［13］ 馬英,楊志明,康玉明．中樞腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在慢性心衰時對交感神經(jīng)活動的影響．生理科學(xué)進(jìn)展,2008,39(2):107．

Objective To study the “two-kidney one-clip”（2K1C）hypertension model in mice and high-salt diet combined with Aconite decoction to build hypertension model conformity in TCM liver Yang hyperactivity syndrome type. Methods Thirty-two Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into empty group，high-salt diet combined with Aconite decoction group（TCM made model group），sham operation group，“double-kidney one-clip” method group（surgery made model group）. The rat models were evaluated thereafter by rats tail arterial pressure detection，kidney index，symptoms and signs observation，kidney pathology biopsy，and statistical methods of statistics processing. Results Compared with empty group，the change of blood pressure in TCM made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）；compared with sham operation group，the change of blood pressure in surgery made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）. No obvious difference was found between TCM made model group and surgery made model group（P＞0.05）；compared with empty group，the scores of TCM made model group after modeling was of signifi cant difference（P＜0.01）；compared with sham operation group，the scores of surgery made model group after modeling had no obvious difference（P＞0.05）.The scores of TCM made model group had signifi cant difference（P＜0.01）；compared with empty group，the kidney index in TCM made model group had no obvious difference（P＞0.05）；compared with sham operation group，the kidney index in surgery made model group was of signifi cant difference（P＜0.01）.There's signifi cant difference between TCM made model group and surgery made model group（P＜0.01）；compared with empty group，the pyknic situation in TCM made model group had no obvious change；compared with sham operation group，the pyknic situation in surgery made model group was obviously shrank. There's signifi cant difference between TCM made model group and surgery made model group；compared with empty group，there were no differences in the morphology of glomerular tubular；compared with sham operation group，surgery made model group appeared glomerular atrophy. Conclusion The “2K1C”hypertension model and the high-salt diet combined with Aconite decoction hypertension model are both successful Hypertension modules，but compared with the “2K1C” hypertension model，the high-salt diet combined with Aconite decoction hypertension model is more accordant with TCM liver-Yang hyperactivity syndrome type.

Hypertension Modules Combination of diseases and syndrome

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院*通信作者