二甲雙胍對小鼠肝纖維化保護作用的研究*

郭莉娜，李 燦，譚悅浩，孔德華，胡康安，鄧峰美△，王航宇，馬 燕，劉漪淪

1.成都醫學院 基礎醫學院(成都610500)；2.新疆石河子大學 藥學院(石河子832000)；3.成都醫學院第一附屬醫院(成都610500)

肝纖維化是全球常見疾病，主要由病毒性、酒精性、藥物性、代謝性、膽汁淤積性等慢性肝臟損傷引起。當這些損傷反復持續存在時，機體發生修復反應，形成了肝臟纖維化。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積是肝纖維化最具特征性的改變，其合成與降解水平失衡是肝纖維化發生的主要原因，這一過程可在一定程度上發生可逆性改變[1-2]。肝纖維化特點是膠原蛋白過度積累和肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)異常激活。當HSC發生激活、增殖和趨化反應后，引起多種促纖維化細胞因子分泌，從而促進膠原合成增加[3]。肝纖維化可發展為肝硬化，甚至肝癌，所以需積極探索其逆轉方法。目前，主要治療肝纖維化的方法是藥物治療，通過減少肝臟持續損傷，逆轉肝纖維化。積極探索新藥應用于肝纖維化疾病，可以明顯減少肝硬化、肝癌發生。

二甲雙胍作為雙胍類口服降糖藥，是治療2型糖尿病的首選藥物，已在臨床應用多年[4]。研究[5-6]證明，二甲雙胍除降糖作用外，還有抗癌、抗炎、抗衰老等作用。二甲雙胍在多囊卵巢綜合征臨床治療中已得到認可[7]。在動物實驗[8-10]中也證明，該藥物對子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌等有一定改善作用。近期文獻[11]顯示，二甲雙胍可以治療小鼠肝纖維化，具體機制需進一步驗證。本實驗利用CCl4建立小鼠肝纖維化模型，通過二甲雙胍進行干預，初步研究二甲雙胍對肝纖維化的保護作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6J小鼠、SPF級別、4周齡、體重20～25 g。購自成都達碩公司，實驗動物生產許可證：SCXK(川)2013-024。實驗前動物適應環境1周，飼養條件：溫度20～25 ℃，相對濕度35%～40%，自由進食飲水。

1.1.2 細胞 LX-2細胞購自復旦IBS細胞中心，于CO2培養箱內培養。生長環境為：溫度37 ℃，CO2濃度5%；給予10%胎牛血清+雙抗+DMEM-H培養基，隔天換液，3～5 d傳代，于超凈工作臺進行細胞復蘇、換液等操作。

1.1.3 試驗藥物與試劑 二甲雙胍(北京索萊寶生物科技有限公司)；CCL4分析純AR(500 mL/瓶)(購自成都科龍化工試劑廠)；ALT、AST試劑盒(購自南京建成試劑公司)；HE染色試劑(博谷生物)；天狼星紅染色試劑盒(博谷生物)；兔抗α-SMA抗體(中杉金橋)，山羊抗兔IgG(中杉金橋)；DMEM-H培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；雙抗購于 R&D公司；PDGF-BB購自美國PeproTech公司；基質膠(Matrigel)購自湖南佳浩能生物科技公司；24孔Transwell小室購自海貍生物科技有限公司等。

1.1.4 實驗儀器 組織切片機(RM2016)、組織包埋機(EG1150H)購自LEICA；生物顯微鏡(CX21FS1C)購自奧林巴斯工業有限公司；Roche Modular D2400生化分析儀購自瑞士Roche公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2培養箱購于Thermo公司；超凈工作臺購于Thermo公司等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥方法 將45只4周齡的小鼠隨機分為3組，每組各15只，即正常組、模型組和二甲雙胍治療組；模型組給予橄欖油、CCL4混合物處理，按1∶3比例，經腹腔注射，2 次/周，劑量為0.4 mL/kg；正常組給予相同容量橄欖油，經腹腔注射，2 次/周，劑量為0.4 mL/kg；二甲雙胍治療組造模方法同模型組。造模3周后，給予各組小鼠相對應藥物，二甲雙胍治療組給予二甲雙胍200 mg/次，1次/d，灌胃；正常組、造模組給予生理鹽水，200 mg/次，1 次/d，灌胃，造模6周后處死小鼠，收集標本。

1.2.2 細胞分組與給藥方法 將對數生長期的LX-2細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成細胞懸液，接種于12個培養皿中，平均分為4組，即空白對照組、PDGF-BB組、PDGF-BB+Met低劑量組和PDGF-BB+Met高劑量組。空白對照組不做處理；PDGF-BB組給予10 ng/mL的細胞因子PDGF-BB誘導細胞活化；PDGF-BB+Met低劑量組給予10 ng/mL的細胞因子PDGF-BB和5 mmol/L的二甲雙胍；PDGF-BB+Met高劑量組給予10 ng/mL的細胞因子PDGF-BB和10 mmol/L的二甲雙胍。于48 h后，觀察細胞狀態，收集各組細胞蛋白。

1.2.3 實驗指標測定 檢測血清中AST、ALT的含量，實驗步驟根據試劑盒說明操作。

1.2.4 組織病理學檢測 取出的小鼠肝臟經甲醛固定、石蠟包埋、切片后，行天狼星紅染色，將烤片機溫度調至65 ℃，在烤片機中將片子復烤約 40 min，二甲苯脫蠟，酒精水化，片子在自來水下輕沖3 min×3 次，標本處滴加天狼星紅染色液時間約60 min，自來水沖洗，用 Mayer 蘇木素復染細胞核時間約1 min，自來水沖洗7～8 min，進行乙醇脫水處理，將片子放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明各 15 min，中性樹脂封片，生物顯微鏡觀察拍照。HE染色，烤片、脫蠟、水化步驟同上，染色時先用蘇木精染色約3 min，自來水輕輕沖洗4 min，1%鹽酸酒精分化15 s，再次用自來水輕沖約1.5 min，氨水反藍染色1 min，自來水輕輕沖洗約5 min，再用1%伊紅染色3 min，再次自來水洗4 min，片子脫水、透明同天狼星紅染色，生物顯微鏡鏡檢，并拍攝照片。

1.2.5 免疫組織化學染色分析 取5 μm切片，行烤片、脫蠟、水化操作。用EDTA抗原修復液修復抗原。在組織上滴加3%H2O2阻斷過氧化物酶活性，使其完全覆蓋組織，在37 ℃恒溫培養箱孵育0.5 h。滴加已配好的α-SMA抗體(即一抗)，將切片放入濕盒，4 ℃冰箱過夜。次日，取出切片，放入1×PBS中浸泡，3 min/次×3次。切片組織上加山羊抗兔二抗，室溫下放置約30 min,1×PBS中浸泡，3 min/次×3次，在組織上滴上二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染3 min,脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察顯色情況，選取不同視野拍照。

1.2.6 細胞克隆形成實驗 將對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，計數后稀釋，將細胞懸液平均種于六孔板中。將六孔板放入CO2培養箱待細胞貼壁，次日將細胞培養基更換為無血清的DMEM約10 h，再次給細胞換液，根據分組給予每孔不同的處理方式，正常組加10%胎牛血清的DMEM培養基，其他組在此基礎分別多加入PDGF-BB、PDGF-BB+5 mg/mL Met、PDGF-BB+10 mg/mL Met，每個孔設置3個復孔，當六孔板中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞，時間約15 min，棄固定液，加適量GIMSA應用染色液，時間約20 min，水流輕沖染色液，空氣干燥，將六孔板倒置，疊加網格透明膠片，用肉眼直接計數克隆。

1.2.7 Western blot檢測 將已處理好的細胞用PBS緩慢沖洗3次后刮下，收集細胞加入離心管中，置于離心機中離心，3 000 r/min，離心半徑8 cm，離心5 min，棄上清，得細胞沉淀，加入裂解液，使細胞與裂解液充分混合后，移入EP管，將EP管置于冰面上40 min，每10 min旋轉混勻1次，促進細胞裂解，再次離心，條件：4 ℃，12 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心20 min，離心所得上清液即為所需蛋白。使用5×蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后，于95 ℃中加熱10 min，待其充分變性。上機跑電泳，隨后轉膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，TBST沖洗，用5%脫脂牛奶稀釋α-SMA抗體，將膜浸于其中，封口機封閉，將膜浸于其中，置于4 ℃冰箱過夜；將PVDF膜取出，TBST溶液洗滌，時間10 min,重復3次；稀釋山羊抗兔抗體，封口機封閉，置于37 ℃恒溫搖床上孵育 2 h，將PVDF膜取出，丟棄二抗，TBST溶液洗滌，時間10 min,重復3次。配置顯色液A液和B液，按比例1∶1(體積/體積)，混勻。將顯色液均勻滴加與PVDF膜上，置于化學發光顯影儀中進行顯影。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肝臟功能的變化

模型組小鼠的肝臟功能相關指標AST、ALT含量較正常組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，二甲雙胍治療組小鼠AST、ALT含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 血清中肝功能相關指標ALT、AST含量注：與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

2.2 肝臟組織病理學的變化

2.2.1 HE染色 正常小鼠肝臟內肝小葉正常，肝細胞索整齊排列，間質內無炎性細胞浸潤；與正常組比較，模型組小鼠匯管區內出現粗大的膠原纖維條索分割包繞，纖維間隔明顯增厚，肝小葉結構明顯異常，有假小葉形成，肝細胞索排列紊亂，間質內炎性細胞浸潤明顯；與模型組相比，二甲雙胍治療組膠原纖維的增生減輕，假小葉形成改善，炎性細胞浸潤程度減輕(圖2)。

圖2 肝臟HE染色(×100)注：A：正常組；B：CCL4+PBS組；C：CCL4+二甲雙胍組

2.2.2 天狼星紅染色 正常組中可見少量膠原分布；與正常組比較，模型組中出現大量膠原沉積，分布廣泛，在匯管區間分布較多與模型組比較，二甲雙胍治療組有部分膠原增生，肝小葉中可見少量間隔形成(圖3)。

圖3 肝臟天狼星紅染色(×100)注：A：正常組；B：CCL4+PBS組；C：CCL4+二甲雙胍組

2.2.3 免疫組化檢測小鼠肝臟組織α-SMA表達 正常組小鼠肝臟基本無α-SMA表達；與正常組比較，模型組α-SMA表達明顯增高；與模型組比較，二甲雙胍治療組α-SMA表達降低(圖4)。

圖4 肝臟α-SMA免疫組化的染色結果(×100)注：A：正常組；B：CCL4+PBS組；C：CCL4+二甲雙胍組

2.2.4 細胞克隆形成實驗觀察細胞增殖能力 與空白對照組比較，PDGF-BB組細胞增殖能力明顯升高；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+Met低劑量組細胞增殖能力下降；與PDGF-BB+Met低劑量組比較，PDGF-BB+Met高劑量組細胞增殖能力進一步下降，呈劑量依賴性(圖5)。

圖5 LX-2細胞克隆形成

2.2.5 二甲雙胍能抑制肝星狀細胞活化 Western blot檢驗結果示：與空白對照組比較，PDGF-BB組α-SMA表達明顯升高(P<0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+Met低劑量組α-SMA表達明顯降低(P<0.01)；與PDGF-BB+Met低劑量組比較，PDGF-BB+Met高劑量組α-SMA表達進一步降低(P<0.01)(圖6)。

圖6 Western blot檢測二甲雙胍干預后LX-2細胞內α-SMA的表達注：A：Western blot檢測各組細胞α-SMA的表達；B：各組細胞α-SMA蛋白表達水平統計結果；與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01；與PDGF-BB+Met低劑量組比較，△△P<0.01

3 討論

肝纖維化是各種致病因子作用、ECM積累和損傷修復長期持續存在導致的病理過程[12]。肝纖維化損傷修復破壞肝臟正常結構，肝小葉結構出現異常改變，血管結構發生紊亂，同時肝細胞數量減少。各致病因素作用于肝細胞，使其分泌多種細胞生長因子、纖維化相關細胞因子、炎性因子等，從而刺激HSCs活化。HSCs一直被認為是肝纖維化發生發展環節中的最關鍵因素，其在靜息期可調節肝內脂質平衡[13]。HSCs活化后，細胞內脂類丟失，增殖、遷移能力增強，可分泌大量 ECM能力。α-SMA表達量也明顯增加，其含量且與細胞活化程度呈正相關。同時,HSCs與周圍細胞相互作用，分泌大量細胞因子、趨化因子而促進肝纖維化發生[14]。因此，抑制HSCs活化可有效改善肝纖維化的發生。

肝纖維化最終向肝硬化、肝癌發展。肝癌是一種快速生長的惡性腫瘤，有60%～80%的患者診斷時即為肝癌晚期，且根治性切除機會極少，從而喪失了治療機會，對人類是一種嚴重而危險的威脅[15]，肝纖維化可在一定程度上逆轉，所以可通過預防或治療肝纖維化而有效減少肝癌發生。因此，要積極探索肝纖維化治療新藥，迫切需要發現更有效的治療靶點，以改善治療效果。

二甲雙胍為胰島素增敏劑，抑制糖異生及肝糖原的分解，是非常有效的降糖藥物，現為2型糖尿病治療首選藥物[16]。近年通過流行病學調查研究[17-18]發現，二甲雙胍具有保護心血管、抑制腫瘤、治療非酒精性脂肪肝等作用。二甲雙胍可激活蛋白激酶(AMPK)，緩解心臟缺血后的炎性反應，保護心臟功能；AMPK活化還能夠抑制多種器官纖維化發生，其中對肝纖維化有明顯影響[19-20]。本實驗從病理學角度研究二甲雙胍對CCL4誘導的小鼠肝纖維化的影響，結果顯示，二甲雙胍可改善肝臟內炎性細胞浸潤，減輕膠原纖維的形成，纖維化病變程度明顯減輕。同時，二甲雙胍可抑制HSCs活化與增殖。

綜上所述，二甲雙胍可通過抑制HSCs活化而在一定程度上改善肝纖維化發展，其具體機制需進一步研究發現。