麻杏石甘湯對肺炎模型小鼠的療效觀察及對共刺激分子CD137水平的影響

柴少卿 于少飛 朱華

摘要? 目的：觀察麻杏石甘湯對肺炎模型小鼠的療效，同時探討其對共刺激分子CD137水平的影響。方法：選取60只無特定病原體（SPF級）幼齡小鼠納入研究，并隨機分為空白組、模型組及中藥組，每組20只。其中模型組及中藥組小鼠接受肺炎克雷伯菌混懸液滴入鼻腔，空白組小鼠接受等劑量生理鹽水滴鼻，24 h中藥組小鼠接受麻杏石甘湯灌胃，1劑/d，共干預7 d。比較3組小鼠一般活動情況、外周血中的白細胞計數、多核粒細胞激素（PMN）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、肺組織病理改變以及外周血單核細胞中共刺激分子CD137水平的變化。結果：空白組小鼠未出現任何陽性體征，模型組及中藥組小鼠出現精神萎靡、體質量下降、活動減少等相關陽性癥狀，其中中藥組較模型組改善;模型組及中藥組小鼠外周血白細胞計數、PMN、IL-6及IL-8均較空白組升高，差異有統計學意義（ P <0.05），其中中藥組優于對照組（ P <0.05）。模型組及中藥組小鼠肺組織細胞結構錯亂、肺泡大小不一，各級支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細胞浸潤，部分有纖維增生。其中中藥組較模型組病理明顯改善。模型組及中藥組小鼠外周血共刺激分子CD137表達增高，與空白組比較差異有統計學意義（ P <0.05），其中中藥組水平低于模型組，差異有統計學意義（ P <0.05）。結論：麻杏石甘湯加減對肺炎有明顯臨床效果，其作用機制可能與抑制共刺激分子CD137的分泌有關。

關鍵詞? 肺炎模型;肺炎克雷伯菌;小鼠;麻杏石甘湯;CD137

Effects of Maxing Shigan Decoction on Pneumonia Model Mice and Its Effect on CD137 Level of Costimulatory Molecule

Chai Shaoqin，Yu Shaofei，Zhu Hua

（Pediatric Department，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010010，China）

Abstract Objective： To observe the curative effect of Maxing Shigan Decoction on pneumonia model mice，and to explore its effects on the level of costimulatory molecule CD137. Method：A total of 60 SPF-free young mice were randomly divided into blank group，model group and Traditional Chinese Medicine group with 20 mice in each group. The mice in the model group and Traditional Chinese Medicine group were given Klebsiella pneumoniae suspension by dripping into the nasal cavity，the mice in the blank group were given the same dose of normal saline nasal drops，the mice in Traditional Chinese Medicine group were given Maxing Shigan Decoction intragastric administration for 24 hours，one dose per day，for 7 days. The general activity，peripheral blood （WBC），polymorphonuclear hormone （PMN），interleukin-6 （IL-6），interleukin-8 （IL-8），lung histopathology and the concentration of costimulatory molecule CD137 in peripheral blood mononuclear cells were compared.? Results： There were no positive signs in the blank group mice，but the model group mice and Traditional Chinese Medicine group mice showed mental dispirity，weight loss，decreased activity，and decreased fur gloss，and Traditional Chinese Medicine group mice were better than the model group mice. WBC，PMN，IL-6 and IL-8 in the peripheral blood of the model group mice and Traditional Chinese Medicine group mice were higher than the blank group mice，the difference was statistically significant （ P <0.05），Traditional Chinese Medicine group was better than the control group （ P <0.05）. There were a lot of inflammatory cells infiltrating around bronchi，interlobular and alveolar septum，and some fibrosis in the model group and Traditional Chinese Medicine group. Traditional Chinese Medicine group improved significantly compared with the model group. The expression of costimulatory molecule CD137 in peripheral blood of mice in model group and Traditional Chinese Medicine group was higher than that in blank group （ P <0.05）. The level of costimulatory molecule CD137 in Traditional Chinese Medicine group was lower than that in model group （ P <0.05）.? Conclusion： Maxing Shigan Decoction has obvious clinical effect on pneumonia，and its mechanism may be related to the inhibition of the secretion of costimulatory molecule CD137.

Key Words? Pneumonia model pneumonia; Klebsiella mice; Maxing Shigan Decoction; CD137

中圖分類號：R289.4;R563.1 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.019

細菌性肺炎是常見的肺炎類型，是臨床常見的感染性疾病之一，亦是導致我國兒童死亡的主要病因，遠超過因艾滋病、瘧疾和麻疹死亡兒童人數的總和，但由于病原體的變遷、抗生素濫用等因素導致臨床療效差強人意。據目前已知研究[1-3]，細菌性肺炎的發生發展與多種炎性細胞及活性因子的級聯效應導致氣道慢性炎性反應有關，在此病理環節中T淋巴細胞的活化具有重要作用，貫穿炎性級聯反應始終，而T淋巴細胞的異常激活與與其表面共刺激分子的活化關系密切。有研究發現，細菌性肺炎患兒外周血T淋巴細胞表面共刺激分子被明顯活化，因此我們設想，抑制T淋巴細胞表面共刺激分子可能是細菌性肺炎的靶向治療。中醫古籍并無“細菌性肺炎”的病名記載，根據其臨床癥狀將其歸屬于“咳嗽”“喘證”等范疇，好發于兒童，中醫認為小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，極易外感風邪，夾寒夾熱入侵與肺，影響肺氣宣發肅降，最終致肺氣郁遏，痰阻肺絡而成此病。麻杏石甘湯首載于《傷寒論》，有辛涼宣泄，清肺平喘之功效，具有嚴謹的用藥配伍，與細菌性肺炎的病機一一對應，臨床亦不乏麻杏石甘湯治療細菌性肺炎有效的臨床報道[4-6]，但對其作用機制尚無統一定論，基于此，我們利用麻杏石甘湯對60只SPF級小鼠進行研究，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取60只無特定病原體（SPF級）幼齡小鼠，體質量30～40 g，平均體質量（31±1.1）g。鼠齡2～3個月，平均鼠齡（2.1±0.5）月。所有小鼠均購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號：SCXX（滬）2011-00241。所有動物飼養于本院動物實驗中心，飼養條件：溫度（23.5±0.5）℃，濕度（52±1.5）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 麻杏石甘湯由本院中藥研究院提供，中藥組成：麻黃6 g、杏仁9 g、生石膏24 g、甘草6 g。

1.1.3 試劑與儀器

肺炎克雷伯菌株（本院檢驗科細菌室提供）;IL-6 ELISA試劑盒（貨號kt37687，購自武漢默沙克生物科技有限公司）;IL-8 ELISA試劑盒（貨號kt32377，購自武漢默沙克生物科技有限公司）;全自動生化儀（AU5800，購自美國貝克曼庫爾特公司）;酶標儀（購自美國Molecular Devices公司）;CD137抗體（貨號ab9822，購自Abcan公司）;β-actin抗體（貨號28341，購自CST公司）;二抗羊抗小鼠Ig-HRP（貨號3928347，購自北京中衫生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取只無特定病原體（SPF級）幼齡小鼠納入研究，隨機分為空白組（20只）、模型組（模型制備20只）及中藥組（20只）。3組小鼠體質量、鼠齡比較，差異無統計學意義（ P >0.05），具有可比性。本研究方案經過本院倫理委員會批準。

模型制備參照參考文獻[7-8]中的模型制備方法：將小鼠充分麻醉后置于手術臺上，頸部備皮后消毒，將氣管充分暴露于操作者視野，用1 mL注射器刺入氣管滴入克雷伯菌懸濁液0.15 mL（用生理鹽水稀釋成1.2×1011cfu/L），空白組小鼠注入等劑量的生理鹽水，造模后縫合小鼠皮膚、常規消毒后使小鼠保持豎立狀態20 s。

1.2.2 干預方法

根據小鼠與人體間等效劑量換算0.66 g/mL對中藥組小鼠進行灌胃，每日灌胃1次，空白組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃，3組均連續灌胃7 d，麻杏石甘湯：麻黃3 g、苦杏仁3 g、石膏9 g、甘草2 g。

1.2.3 檢測指標與方法 1）一般狀況評分：對3組小鼠精神狀況、體質量、活動量、皮毛光澤度進行觀察比較。2）血細胞計數比較：對3組小鼠外周血白細胞計數、多核粒細胞激素（PMN）計數進行比較。白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）水平比較：干預后從3組隨機選取3只小鼠，充分麻醉后抽取腹主動脈血10 mL，置于4 ℃，2 000 r/min條件下充分離心15 min，抽取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）進行檢測，將IL-6及IL-8抗體用碳酸鹽包被緩沖液稀釋后適量濃度后加至反應孔中，每孔加入0.1 mL，將反應板置于4 ℃條件下孵育過夜，隨后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）反復沖洗3次，1 min/次，隨后加入3組樣本，室溫下靜置1 h，隨后往各反應孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，室溫下充分反應1 h后加入硫酸0.05 mL顯色，將反應孔板置于酶標儀內讀取A值。整個過程嚴格按照說明書進行。3）肺組織病理改變：干預后從3組隨機選取3只小鼠，充分麻醉后取肺部組織，采用蘇木精-伊紅（HE）染色對3組小鼠肺組織的病理形態學進行觀察，具體操作如下：將肺組織取出后置于多聚甲醛內固定24 h，二甲苯（Ⅰ）15 min→二甲苯（Ⅱ）15 min→95%乙醇（Ⅰ）5 min→95%乙醇（Ⅱ）5 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸餾水（Ⅰ）3 min→蒸餾水（Ⅱ）3 min過程進行脫水，隨后將3組樣本進行石蠟包埋，切片后撈片，用蘇木精染色后將玻片置于顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。4）肺組織CD137檢測：干預后從3組隨機選取3只小鼠，充分麻醉后取肺部組織，采用免疫蛋白印跡（Western blotting）對肺組織內CD137水平進行檢測，具體過程如下：將3組樣本中加入裂解液對組織進行充分裂解，隨后將充分裂解的樣本在4 ℃，12 000 r/min條件下進行離心后，吸取上清液，用BCA試劑盒進行蛋白水平測定，將樣本加入事先配制好的電泳凝膠內，進行電泳、轉膜、封閉、孵育CD137及β-actin一抗、孵育二抗后取出聚偏氟乙烯（PDVF）膜，加入ECL顯影液進行顯影，在凝膠成像系統中對顯影結果進行采集及分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行研究數據統計分析。計量資料用均數±標準差（X±S）表示，組間比較采用秩和檢驗;組內比較采用配對秩和檢驗。以 P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠一般情況比較 模型組及中藥組小鼠接受造模當天即出現煩躁活動增強，造模第2天、第3天后小鼠逐漸出現活動量減少，食欲減退，第4天小鼠逐漸出現精神萎靡，體質量下降，部分小鼠出現明顯的呼吸喘鳴音，第5天、第6天部分小鼠出現呼吸急促、顏面部、四肢發紺。與模型組比較，中藥組小鼠癥狀明顯改善。空白組小鼠未出現明顯陽性癥狀體征。

2.2 3組小鼠外周血白細胞計數、PMN計數、IL-6、IL-8比較 模型組及中藥組小鼠外周血白細胞計數、PMN計數、IL-6、IL-8均較空白組升高，差異有統計學意義（ P <0.05），其中中藥組優于對照組（ P <0.05）。見表1。

2.3 2組小鼠肺組織病理學比較

模型組及中藥組小鼠肺組織細胞結構錯亂、肺泡大小不一，各級支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細胞浸潤，部分有纖維增生。其中中藥組較模型組病理明顯改善。見圖1。

2.4 3組小鼠肺組織CD137比較

模型組及中藥組小鼠外周血共刺激分子CD137表達增高，與空白組比較差異有統計學意義（ P <0.05），其中中藥組水平低于模型組，差異有統計學意義（ P <0.05）。見表2及圖2。

3 討論

細菌性肺炎屬于中醫“咳嗽”“喘證”范疇，多由風邪外感而導致。風邪性分寒熱二類，風熱侵表，表邪不解入里，或風寒之邪從口鼻或皮毛入侵后寒隨化熱，肺經被壅束，肺失宣降，郁而化熱，最終里熱大盛，煉液為痰，壅堵氣道，最終加劇肺氣宣降無權之勢。病情輕者者僅有發熱咳嗽，病情重者則里熱大盛，故患兒出現壯熱不退，咳嗽喘憋，呼吸困難等一系列臨床癥狀[9-11]。基于上述病機，中醫治療喘息性肺炎以宣肺散邪、清瀉肺熱為主。麻杏石甘湯首載于《傷寒論》，是治療外感風邪、邪熱壅肺之方，方中麻黃有開宣肺氣平喘之功，亦可開腠理以散表邪;石膏辛甘大寒，可清瀉肺熱及生津止渴，還可透邪解表。麻黃、石膏合用，一溫一寒，即可宣肺又可清肺，且均可祛邪外出，二藥合用相輔相成，即可清除致病之因，又可恢復肺氣宣發肅降之功。杏仁味苦，可降利肺氣，助肺氣肅降之功而平喘，此藥與麻黃合用則宣降相因，與石膏共用則清肅協同。炙甘草有益氣和中之功，與石膏合用可增強君藥生津之功，更可調和于寒溫宣降之間。麻黃、石膏、杏仁、炙甘草四藥合用，共奏解表、宣肺、降氣之功[12-14]。故本研究發現，模型組及中藥組小鼠在接種克雷伯菌后出現出現咳喘、呼吸急促等肺部相關癥狀，與此同時小鼠在接受麻杏石甘湯干預后陽性癥狀明顯緩解，這提示麻杏石甘湯對細菌性肺炎確有理想療效，同時我們對3組小鼠的肺臟進行HE染色，觀察其病理變化，發現接受克雷伯菌接種的小鼠出現肺組織細胞結構錯亂、肺泡大小不一，各級支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細胞浸潤，部分有纖維增生，這提示本研究造模是成功的，我們對中藥組小鼠進行麻杏石甘湯灌胃后顯示小鼠肺臟組織的病理較模型組有明顯改善，這與相關研究結果相似[15-17]。

細菌性肺炎是嬰幼兒常見的臨床疾病，目前研究資料顯示T淋巴細胞異常激活是細菌性肺炎發生的觸發點，其活化過程需要共刺激信號的誘發，而信號由T淋巴細胞膜表面共刺激分子與抗原提呈細胞（APC）表面相應配體結合后產生[18-19]。近年來體內外實驗結果顯示，多種共刺激分子在T淋巴細胞活化、增殖、凋亡等不同階段均有中藥的介導效應。CD137是近年來新發現的T淋巴細胞共刺激分子，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族的重要因子，CD137在T淋巴細胞內存在磷酸化位點，正常整理狀態下該位點處于穩定狀態，從而使CD137在T淋巴細胞表面處于靜止狀態，不進行表達，一旦CD4+、CD8+等T淋巴細胞被異常活化，則CD137磷酸化位點被激活出現了高表達。CD137高表達可進一步促進T淋巴細胞異常活化，從而進一步影響T淋巴細胞介導的免疫功能，加重病情發展，因此抑制CD137的表達被認為是細菌性肺炎的治療新靶向。在本研究中我們發現模型組及中藥組小鼠肺組織CD137水平明顯高于空白組小鼠，經過麻杏石甘湯干預后中藥組小鼠肺組織CD137水平明顯下調，這提示麻杏石甘湯有效抑制細菌性肺炎機體CD137的活化，從而糾正T淋巴細胞的功能[20-22]。

總之，麻杏石甘湯治療細菌性肺炎療效理想，其作用機制可能與抑制共刺激分子CD137的分泌，從而改善了患者的免疫系統功能有關。

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