超高壓液相色譜/線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法鑒定鎖陽(yáng)有效部位的化學(xué)成分

程丹 暢洪昇 王旭 馬素亞 李玲玲 李鑫潔 魯藝

摘要? 目的：評(píng)價(jià)利用超高壓液相色譜/線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC/LTQ-Orbitrapa MS）測(cè)定鎖陽(yáng)改善認(rèn)知功能障礙有效部位的化學(xué)成分。方法：選取Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）色譜柱，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL，流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫。質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，在正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。結(jié)果：共鑒別了21個(gè)化合物，包含6個(gè)潛在新化合物。鑒定的化合物包含核苷類、多酚類、黃酮苷類、氨基酸類、香豆素類化合物。結(jié)論：UPLC/LTQ-Orbitrapa MS方法能快捷、準(zhǔn)確、較全面地鑒定鎖陽(yáng)有效部位的化學(xué)成分，為明確鎖陽(yáng)藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步提取分離提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 超高壓液相色譜;線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜;鎖陽(yáng)有效部位;化學(xué)成分

Rapid Identification and Characterization of Chemical Components in the Active Part of Herba Cynomorii by UPLC/LTQ-Orbitrapa MS

Cheng Dan1，Chang Hongsheng2，Wang Xu1，Ma Suya1，Li Lingling1，Li Xinjie1，Lu Yi1

（1 School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicines，Beijing 100029，China; 2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicines，Beijing 102488，China）

Abstract Objective： To analyze and identify the chemical constituents from the active part of Herba Cynomorii using UPLC/LTQ-Orbitrapa MS （Ultra Performance Liquid Chromatography/Liner Ion Trap-Orbitrapa Mass Spectrometry）. Methods： The analysis was performed on an Acquity UPLC BEH C18 reverse phase column （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）.The injection volume was 5 μL.The flow rate was 0.3 mL/min gradient elution and column temperature was 30 ℃.The mobile phase consisted of acetonitrile （B） and 0.1% formic acid （A） was used as gradient elute.MS conditions were ESI （Electronic Spray Ion），positive and negative ion mode scanning. Results： After the data of mass spectra，pyrolysis rule and characteristic fragment ion information were analyzed，a total of 20 compounds were identified，including nucleosides，phenolic acids，flavonoid glycosides，Coumarins and amino acid. Conclusion： By using UPLC/LTQ-Orbitrapa MS method，the main chemical constituents from Herba Cynomorii can be accurately identified.

Key Words? Ultra-high-pressure liquid chromatography; Linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry; Active part of Herba Cynomorii; Chemical components

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.011

鎖陽(yáng)（Cynomorium songaricum Rupr）俗稱“不老藥”，又名地毛球、鎖嚴(yán)子等，是鎖陽(yáng)科多年生、全寄生種子植物，寄生于蒺藜科白刺屬植物根部。鎖陽(yáng)在中藥中用作補(bǔ)腎、助陽(yáng)、益精、潤(rùn)腸藥物[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗疲勞、調(diào)節(jié)激素水平，調(diào)節(jié)糖代謝等作用[2-5]，本課題組前期對(duì)鎖陽(yáng)的不同部位進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)鎖陽(yáng)乙酸乙酯部位具有雌激素樣作用[6]，對(duì)于癡呆及慢性應(yīng)激所致動(dòng)物認(rèn)知功能障礙具有明顯的改善作用[7-9]，為鎖陽(yáng)治療認(rèn)知功能障礙及抗衰老的有效部位，但對(duì)于此部位的化學(xué)成分并不清楚。

由線性離子阱（Linear Trap Quadrupol，LTQ）與軌道離子阱串聯(lián)的質(zhì)譜儀（Linear Trap Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometry，LTQ-Orbitrap MS）是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，具有高達(dá)100 000的質(zhì)量分辨率、進(jìn)行快速模式切換、高于2 ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可用于未知物的快速篩選和結(jié)構(gòu)確認(rèn)、藥物開發(fā)前期藥代動(dòng)力學(xué)的研究[10]。本研究將其與超高壓液相結(jié)合，利用精確質(zhì)量數(shù)、裂解規(guī)律及特征碎片離子信息，對(duì)于研究鎖陽(yáng)有效部位化學(xué)成分，及相關(guān)化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律具有重要的意義。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 UHPLC（ThermoFisher，包括二元梯度泵，真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，自動(dòng)控溫箱），通過(guò)電噴霧離子源與LTQ Orbitrapa XL質(zhì)譜儀連接，數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Xcalibur2.2.0，質(zhì)譜裂解規(guī)律模擬軟件為Mass Frontier 7.0，均為ThermoFisher。

1.2 試劑

兒茶素，表兒茶素購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院（批號(hào)分別為10877-201604，11987-201501），乙腈（Sigma，批號(hào)：171448）、甲醇（Sigma，批號(hào)：175159）均為色譜級(jí)，甲酸為分析純級(jí)別（福晨化學(xué)）。流動(dòng)相用水由Milli-Q純水系統(tǒng)（18.2 MΩ·cm，Millipore，美國(guó)）制得。

1.3 分析樣品

鎖陽(yáng)藥材產(chǎn)自北京同仁堂飲片有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：601003042），購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。

2 方法

2.1 色譜條件

超高效液相色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）;柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL;流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～7 min，10% ～40% B;7～21 min，40% B;21～21 min，40% ～80% B;21～28 min，80% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）電離源，采用正離子與負(fù)離子2種掃描方式。正離子模式噴霧電壓4KV，負(fù)離子模式噴霧電壓-3KV。儀器操作參數(shù)為：鞘氣（Sheath Gas）40單位;毛細(xì)管溫度（Calillary Temp）320 ℃;毛細(xì)管電壓（Capillary Voltage）25 V，管透鏡（Tube Lens）電壓110 V。質(zhì)量掃描范圍為：100～1 200。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱量?jī)翰杷?.4 mg、表兒茶素4.2 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，冷藏待用。

2.3 供試品溶液的制備 取適量鎖陽(yáng)粉末，用乙醇浸泡24 h，超聲1 h，重復(fù)3次，過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得甲醇提取物，將甲醇提取物溶解于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，回收乙酸乙酯至干，得乙酸乙酯提取物萃取物。精密稱量乙酸乙酯萃取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，冷藏待用。

3 結(jié)果

采用上述優(yōu)化后分析條件，鎖陽(yáng)提取物中的化學(xué)成分可以得到較好分離，對(duì)其正負(fù)離子模式分析，得到鎖陽(yáng)提取物的總離子流（TIC）色譜圖如圖1所示。根據(jù)實(shí)測(cè)碎片信息并結(jié)合參考文獻(xiàn)，以及相關(guān)化合物的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜、同位素的分布和化合物裂解規(guī)律，進(jìn)行未知化合物的分析與鑒別。已鑒定的化合物保留時(shí)間、質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

2.4.1 核苷類鑒定 化合物2保留時(shí)間為1.19 min，一級(jí)質(zhì)譜圖中 m/z? 268.104 03[M+H]+，準(zhǔn)分子離子給出C10H13O4N5分子式。其二級(jí)質(zhì)譜主要 m/z? 135離子碎片，是由母離子失去一份子核糖（Rib）形成。其二級(jí)質(zhì)譜與銀線蓮中腺苷的數(shù)據(jù)一致[11]，故鑒定化合物2為腺苷。腺苷是核苷類的主要成分，是構(gòu)成核酸DNA、RNA的重要前體，也是能量代謝的重要中間體[12]。腺苷可能的裂解方式如圖2。

2.4.2 多酚類化合物鑒定

化合物1，3，4，7，9，10，11，12，保留時(shí)間分別是0.97 min，2.39 min，2.78 min，3.32 min，3.98 min，4.34 min，4.63 min，4.85 min，這8個(gè)化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰分別如下：化合物1? m/z? 577.137 39，化合物3和9? m/z? 577.137 82，化合物4和7? m/z? 577.137 57，化合物10? m/z? 577.137 88，化合物11? m/z? 577.137 51，化合物12? m/z? 577.137 63，這8個(gè)化合物均給出分子式C30H26O12。8個(gè)色譜峰在相同的二級(jí)質(zhì)譜條件下，均能產(chǎn)生 m/z? 245，287，407，425，451的離子碎片，只是相對(duì)豐度有些差異，提示這8個(gè)化合物應(yīng)為同分異構(gòu)體，初步判定這些化合物為原花青素B，原花青素有多種二聚體形式的同分異構(gòu)體，以2個(gè)結(jié)構(gòu)單元C4-C8、C4-C6位連接的兒茶素或表兒茶素的結(jié)構(gòu)單元間聚合成二聚體形式較為常見(jiàn)，即原花青素B1-B8[13-14]。根據(jù)原花青素B類同分異構(gòu)體的反相液相色譜洗脫順序[15]，推測(cè)化合物1，3，4，7，9，10，11，12分別為原花青素B1，B3，B4，B2，B6，B8，B7，B5?；衔?保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜離子碎片與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，因此推測(cè)化合物7為花青素B2。

化合物5，8，保留時(shí)間分別為3.08 min，3.87 min，一級(jí)質(zhì)譜圖均顯示 m/z? 289.070 66[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，且均給出分子式C15H14O6。二者的二級(jí)質(zhì)譜均有 m/z? 245[M-H-CO2]-，及 m/z? 205[M-H-2C2H2O]-的碎片峰，但豐度不同。由于二者峰成對(duì)出現(xiàn)，裂解規(guī)律相似，因此推測(cè)這2個(gè)化合物為同分異構(gòu)體。根據(jù)兒茶素、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜離子碎片及文獻(xiàn)中[16-18]二級(jí)質(zhì)譜碎片峰和裂解規(guī)律，鑒定化合物5，8分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物6，保留時(shí)間為3.11 min，一級(jí)質(zhì)譜顯示 m/z? 139.03897[M+H]+，準(zhǔn)分子離子峰給出分子式C7H6O3。[M+H]+作為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后發(fā)生斷裂產(chǎn)生特征碎片 m/z? 94，由前者丟失COOH所得。參考水楊酸的裂解方式[19]，鑒定化合物6為水楊酸。

化合物14，保留時(shí)間為5.27 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示 m/z? 441.081 62[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，且給出分子式C22H18O10。二級(jí)質(zhì)譜有 m/z? 289[M-H-C7H4O4]-， m/z? 245[M-H-C8H4O6]-， m/z? 205[M-H-C11H8O6]-， m/z? 179[M-H-C13H10O6]-的碎片峰，后3個(gè)碎片峰應(yīng)為 m/z? 289碎片峰進(jìn)一步發(fā)生環(huán)裂解，分別丟失CO2，2C2H2O，C6H6O2所得。對(duì)比表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)中該化合物二級(jí)質(zhì)譜離子碎片峰和裂解規(guī)律[18]，鑒定化合物14為表兒茶素沒(méi)食子酸酯。

2.4.3 黃酮苷元類化合物鑒定

化合物13，保留時(shí)間為5.19 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示 m/z? 465.102 75[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，給出分子式為C21H20O12。二級(jí)質(zhì)譜有 m/z? 303[M-glucosyl+H]+， m/z? 274[M-glucosyl-CHO+H]+，即母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后糖苷鍵斷裂形成 m/z? 303的碎片峰，后者再次丟失CHO形成 m/z? 274的碎片峰。參照文獻(xiàn)中二級(jí)質(zhì)譜離子碎片峰及保留時(shí)間[20]，鑒定化合物13為異槲皮苷。

化合物15，保留時(shí)間為5.74 min，一級(jí)質(zhì)譜顯示 m/z? 341.123 09[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，確定化合物15的相對(duì)分子質(zhì)量為342，其二級(jí)質(zhì)譜含有 m/z? 161.1040[M-glucosyl-H2O]-的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)松苷的MS分析結(jié)果[21]，鑒定化合物15為松苷。

化合物17，保留時(shí)間為5.99 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示 m/z? 449.107 84[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，給出分子式C21H20O11。準(zhǔn)分子離子峰失去 m/z 162，產(chǎn)生碎片離子明顯的苷元母核離子 m/z? 287[M-162+H]+，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量，初步判定失去的中性片段為葡萄糖。結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)木犀草苷的MS分析結(jié)果[22-23]，鑒定化合物17為木犀草苷。

化合物19，保留時(shí)間為6.17 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示? m/z? 433.112 92[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，給出分子式C21H22O10。二級(jí)質(zhì)譜圖有 m/z? 271[M-162-H]-，推測(cè)為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜丟失一份子葡萄糖所得，文獻(xiàn)中南酸棗苷一級(jí)質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)鑒定時(shí)顯示其母核為二氫芹菜素，并含有1個(gè)β-D-葡萄糖基，推測(cè)化合物19為柑桔素-4-O-吡喃葡萄糖苷（南酸棗苷）[24-25]。

化合物20，保留時(shí)間為6.51 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示 m/z? 435.128 57[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，給出分子式C21H24O10。二級(jí)質(zhì)譜有 m/z? 273[M-glucosyl-H]-的碎片峰，為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜丟失一份子葡萄糖所得，鑒定化合物20為根皮苷[26]。

2.4.4 香豆素類化合物鑒定 化合物16，18，保留時(shí)間分別為5.76，6.14 min，一級(jí)質(zhì)譜圖均顯示 m/z? 341.0655[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，且給出分子式C18H14O7。2個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜均有 m/z? 190，但豐度有差異，因此認(rèn)為這2個(gè)化合物為同分異構(gòu)體，推測(cè)這2個(gè)化合物為Epiphyllocoumarin，Isoepiphyllocoumarin[27]。Epiphyllocoumarin已在鎖陽(yáng)中被鑒定出[28]，因此推測(cè)Isoepiphyllocoumarin為鎖陽(yáng)的潛在新化合物。2個(gè)化合物可能的裂解規(guī)律如圖3所示。

2.4.5 氨基酸類的鑒定 化合物21，保留時(shí)間為24.45 min，一級(jí)質(zhì)譜圖顯示 m/z? 150.058 32[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，給出分子式C5H11O2NS。二級(jí)質(zhì)譜有 m/z? 104[M-COOH+H]+碎片峰，為母離子斷裂COOH鍵所得，推測(cè)化合物27為蛋氨酸[29]。蛋氨酸可能的裂解方式如圖4所示。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC/LTQ-Orbitrapa MS快速分析的方法，采用正、負(fù)2種離子模式進(jìn)行檢測(cè)，在分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式更適用于鎖陽(yáng)乙酸乙酯部位的成分鑒定?；诨衔锏木_相對(duì)分子量、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖和參考文獻(xiàn)，鑒定了鎖陽(yáng)改善認(rèn)知功能障礙有效部位的21個(gè)化合物，并推測(cè)出鎖陽(yáng)中潛在的6個(gè)新化合物。在此次研究中，我們推測(cè)出花青素B的各種異構(gòu)體，除原花青素B3已在鎖陽(yáng)中被報(bào)道[30]，其余原花青素B類同分異構(gòu)體可能是鎖陽(yáng)中的潛在新化合物。但目前不能區(qū)分花青素B異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)，事實(shí)上，在分離和表征高純度低聚物方面存在許多實(shí)際困難。因此，目前采用高分辨質(zhì)譜法很難對(duì)花青素B單個(gè)分子進(jìn)行鑒定或結(jié)構(gòu)表征。

前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，鎖陽(yáng)乙酸乙酯部位具有改善癡呆所致認(rèn)知功能障礙的作用[7-9]，此次通過(guò)采用有效，簡(jiǎn)便快速的分析方法對(duì)該部位化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，為進(jìn)一步從該部位總分離出藥效活性成分提供科學(xué)依據(jù)。

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