外泌體聯合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復作用

景雷　歐愛春　李亞男　王英振

[摘要]目的探討多聚蛋白多糖（Aggrecan）過表達載體修飾骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源外泌體聯合絲素蛋白支架對新西蘭大白兔軟骨缺損的修復作用。方法培養兔源性BMSCs，流式細胞儀檢測第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表達。慢病毒Aggrecan過表達質粒轉染BMSCs，超速離心法提取外泌體，Western Blot方法檢測外泌體分子標志物CD81和CD63的表達。構建絲素蛋白支架聯合外泌體復合物，利用掃描電鏡技術檢測絲蛋白支架的結構。利用蘇木精`-伊紅（HE）染色和番紅`-快綠染色檢測新西蘭大白兔軟骨缺損模型中軟骨結構。結果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表達分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45表達分別為3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan過表達載體轉染效率為（95±2）%。掃描電鏡觀察顯示，外泌體為直徑40～100 nm雙層膜的膜狀結構。Western Blot檢測顯示，外泌體可以表達分子標志物CD81和CD63。HE染色和番紅`-快綠染色結果顯示，Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復作用明顯優于BMSC組和陰性對照組（F=19.298、12.548，P<0.05）。結論Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復具有明顯的促進作用，可為骨性關節炎治療提供新的思路與方法。

[關鍵詞]外泌體;間充質基質細胞;絲素蛋白支架;骨關節炎

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of exosome derived from Aggrecan overexpression vector`-modified bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） combined with silk fibroin scaffold in the repair of cartilage defect in New Zealand white rabbits. MethodsRabbit`-derived BMSCs were cultured. Flow cytometry was used to measure the expression of CD44， CD29， CD34， and CD45 on the surface of the second`-generation BMSCs. Lentivirus Aggrecan`-overexpression plasmid was transfected into BMSCs， the exosomes were extracted by ultracentrifugation， and Western blot was used to measure the expression of the biomar`-kers CD81 and CD63. The silk fibroin scaffold`-exosome complexes were constructed， and scanning electron microscopy was used to observe the structure of silk fibroin scaffolds. HE staining and safranine`-fast green staining were used to observe cartilage structure in New Zealand white rabbits with cartilage defect. ResultsThe expression rates of CD44 and CD29 on the surface of the se`-cond`-generation BMSCs were 60.2% and 58.3%， respectively， and the expression rates of CD34 and CD45 were 3.4% and 2.6%， respectively. The transfection efficiency of lentiviral Aggrecan`-overexpression vector was （95±2）%. Scanning electron microscopy showed that the exosome had a double`-membrane structure with a diameter of 40-100 nm. Western blot showed that exosomes expressed the molecular markers CD81 and CD63. HE staining and saffron`-fast green staining showed that exosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold had a better effect in repairing cartilage defect than the BMSC group and the negative control group （F=19.298 and 12.548，P<0.05）. Conclusionexosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold can significantly promote the repair of cartilage defect， which provides new ideas and methods for the treatment of osteoarthritis in clinical practice.

[KEY WORDS]exosome; mesenchymal stromal cells; silk fibroin scaffold; osteoarthritis

骨性關節炎（OA）是關節外科最常見的疾病，也是目前臨床上的治療難題，其病理機制主要為軟骨細胞過度凋亡和軟骨基質降解而導致的軟骨缺損[1`-3]。多聚蛋白多糖（Aggrecan）是軟骨基質合成最主要的成分[4`-5]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定誘導條件下，可以分化成人體內的多種細胞[6`-8]，如成骨細胞、軟骨細胞以及神經細胞等[9`-11]。新近研究結果表明，BMSCs在特定誘導條件下可以轉化成成骨細胞，進而促進骨與軟骨損傷的修復;而且BMSCs來源于病人自體，移植后可以避免排斥反應，這為臨床上骨缺損的修復提供了一個新的思路[12]。本研究利用BMSCs的多分化潛能，構建Aggrecan的過表達載體轉染BMSCs，收集外泌體，聯合絲素蛋白支架，探討其對于軟骨缺損的修復作用，以期尋找最優化的治療方案，為OA的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

新西蘭大白兔20只，雌性，年齡為（12.11±3.04）月，體質量（5.47±1.01）kg，購自山東省濟南市實驗動物中心;胎牛血清購自Gibco公司;DMEM、TRIZOL及2.5 g/L的胰酶Trypsin均購自美國Invitrogen公司;氯仿、乙醇（體積分數0.75）及逆轉錄試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR儀購自美國bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1BMSCs分離和培養將兔麻醉后，消毒，鋪巾，利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺針采集新鮮骨髓，按1∶3體積比加入含體積分數0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM細胞培養液，充分混勻后，移入25 cm2的Hank培養瓶中，差速培養法培養，3 d后去掉培養瓶中的油脂等雜質，之后每3 d換1次細胞培養液。BMSCs細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養。

1.2.2BMSCs鑒定采用流式細胞儀檢測BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD34和CD45的表達，采用倒置光學顯微鏡觀察BMSCs的細胞形態。

1.2.3慢病毒Aggrecan過表達載體構建兔源性Aggrecan基因序列從Pubmed genebank中獲得，序列號為NW_003159560;大小為40 893 bp（DNA linear CON 23`-JUN`-2016）;按照RNA過表達序列的構建原則，構建Aggrecan過表達序列，以環狀質粒pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作為質粒的克隆載體。利用慢病毒轉染Aggrecan過表達載體。Aggrecan過表達質粒的構建和慢病毒的轉染均由上海吉凱公司完成。

1.2.4慢病毒細胞轉染取第2代BMSCs，將細胞接種到6孔板，待融合率為50%時進行慢病毒轉染，根據轉染說明書操作，轉染復數（MOI）=50，慢病毒滴度為3×107 mg/L。慢病毒轉染效率=熒光下視野細胞/白光下視野細胞×100%。

1.2.5外泌體的提取和鑒定采用超速離心法收集BMSCs的外泌體，將Aggrecan過表達載體轉染72 h 的BMSCs和無病毒轉染的BMSCs，加入無血清的DMEM培養液，使BMSC的外泌體分泌到培養液中，然后將收集的培養液加入到低溫超速離心機中，分別設置轉速和時間為：300 r/min，15 min;2 000 r/min，15 min;10 000 r/min，30 min;100 000 r/min，70 min。收集純凈外泌體，利用掃描電鏡進行形態鑒定。

1.2.6絲素蛋白支架的制備和檢測利用鹽瀝濾法將2 mL濃度為100 g/L的絲素蛋白溶液灌入24孔板中，加入450～600 μm的NaCl顆粒，室溫風干3 d，鹽析法成型后將絲素蛋白支架晾干，修剪成10 mm×10 mm×10 mm大小圓柱狀絲素多孔支架，消毒后備用。利用掃描電鏡檢測支架結構。

1.2.7實驗分組及處理取20只成年健康新西蘭大白兔，隨機分為空白組、BMSCs組、陰性對照組、實驗組，每組5只。各組動物用150 g/L水合氯醛靜脈麻醉（3 mL/kg）后，常規消毒鋪無菌單，取膝關節正中側切口，逐層切開皮膚、皮下軟組織、淺深筋膜，顯露膝關節股骨側，使用口腔鉆在其軟骨層進行鉆孔，形成長5 mm、寬2 mm、深3 mm的錐形軟骨缺損，制成軟骨缺損模型，生理鹽水沖洗，進行相應干預后逐層縫合。空白組：造模后植入絲素蛋白支架;BMSCs組：造模后植入絲素蛋白支架+BMSCs外泌體復合物;陰性對照組：造模后植入絲素蛋白支架+轉染空白載體BMSCs外泌體復合物;實驗組：造模后植入絲素蛋白支架+轉染Aggrecan過表達載體BMSCs外泌體復合物。

1.2.8蘇木精`-伊紅（HE）染色和番紅`-快綠染色方法檢測軟骨缺損兔模型的軟骨結構14 d后，將實驗動物處死，取4組新西蘭大白兔軟骨缺損組織行HE染色和番紅`-快綠染液染色，40 g/L多聚甲醛固定30 min;脫鈣處理4周;過二甲苯Ⅰ處理15 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ 10 min;體積分數1.00、0.95、0.90、0.85乙醇梯度處理各5 min;二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ 10 min，二甲苯Ⅲ 10 min，體積分數1.00、0.95、0.90、0.85乙醇各處理5 min，自來水沖洗5 min， HE染液和番紅`-快綠染液染色5 min，封片，倒置光學顯微鏡觀察。應用改良O’Driscoll 評分系統評估HE染色結果，改良Mankin評分評估番紅`-快綠染色結果。

1.3統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，結果用±s形式表示，多組數據比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1BMSCs的培養和鑒定

接種48 h后，原代BMSCs開始貼壁，細胞呈梭形或者多角形;培養至第2代后，細胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，增殖迅速。流式細胞儀檢測顯示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29的表達率分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45的表達率分別為3.4%和2.6%。

2.2慢病毒轉染BMSCs效率

慢病毒轉染72 h后觀察顯示，慢病毒轉染效率較高，為（95.07±2.11）%。

2.3掃描電鏡下外泌體聯合絲素蛋白支架復合體的結構

掃描電鏡下不同視窗觀察顯示，支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細胞黏附和遷移。

2.4外泌體的形態學和標志物鑒定

掃描電鏡觀察顯示，外泌體為直徑40～100 nm的雙層膜膜狀結構。Western Blot檢測顯示，外泌體可以表達分子標志物CD81和CD63。

2.5軟骨缺損兔模型軟骨缺損部位HE染色和番紅`-快綠染色觀察

HE染色顯示，空白組軟骨缺損范圍大，炎癥細胞浸潤多;BMSCs組軟骨缺損范圍較空白組明顯減小;陰性對照組炎性細胞減少，支架略有消失;實驗組炎性細胞明顯減少，支架消失，血管生成。實驗組改良O’Driscoll評分低于空白組、BMSCs組、陰性對照組，BMSCs組評分高于空白組，差異均有顯著性（F=19.298，P<0.01）。番紅`-快綠染色結果顯示，空白組軟骨缺損范圍大，并伴有軟骨下骨硬化;BMSCs組軟骨缺損范圍較空白組明顯減小;實驗組軟骨缺損部位有明顯修復，且為纖維組織修復。實驗組改良Makin評分高于空白組、BMSCs組、陰性對照組，BMSCs組評分高于空白組，差異均有顯著性（F=12.548，P<0.05）。見表1。

3討論

本研究根據基因工程和組織工程的原理，以體外培養新西蘭大白兔來源的BMSCs為研究細胞，利用siRNA過表達技術構建Aggrecan的過表達載體，轉染BMSCs，提取轉染后干細胞來源的外泌體，并且通過構建絲素蛋白支架+外泌體復合體，對新西蘭大白兔軟骨缺損部位進行填充和修補，探討Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體對軟骨缺損的修復作用，以期為臨床上具有外側間室軟骨缺損的OA治療提供新的方法。既往研究表明，利用BMSCs復合異種骨基質明膠可以有效修復大鼠橈骨缺損，提示組織支架可以促進BMSCs向骨細胞轉化，進而修復軟骨缺損部位[13`-15]。但是這種方法需要符合特定條件的組織工程支架體系，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs這個“種子細胞”才能更好地在其內生長并且分化，但其臨床應用的安全性有待進一步研究[16`-17]。有研究顯示，利用慢病毒構建基因載體轉染BMSCs并不影響BMSCs的表型[18`-21]。另有研究顯示利用基因工程原理，構建基因過表達的BMSCs也是提高“種子”有效分化的手段[22`-24]。本研究基于該理論，構建Aggrecan基因過表達質粒慢病毒載體轉染BMSCs，制作新型“基因種子”，結果表明，Aggrecan基因過表達質粒慢病毒載體轉染BMSCs具有較高的轉染效率，高達90%以上，可見慢病毒介導Aggrecan基因過表達質粒轉染BMSC是一種高效的轉染方法。

外泌體為一種新興的手段，可以作為無細胞物質提取治療OA的手段之一[25`-28]。有研究結果顯示，在一定條件下，BMSCs可以促進軟骨細胞分化[29]，然而具體的作用機制未知。本研究利用超高速離心的方法，提取Aggrecan基因過表達質粒慢病毒載體轉染BMSCs來源的外泌體，并且利用組織工程原理，構建絲素蛋白支架，聯合外泌體，構建外泌體+絲素蛋白支架體系。進而將基因修飾后干細胞來源外泌體與組織工程支架相結合，通過掃描電鏡觀察外泌體聯合絲素蛋白支架復合體的結構，可觀察到支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細胞黏附和遷移。另外，我們還利用新西蘭大白兔構建膝關節軟骨缺損模型，應用外泌體+絲素蛋白支架復合體對軟骨缺損部位進行填充和修復，HE染色和番紅`-快綠染色對軟骨缺損部位進行觀察，結果表明，實驗組改良O’Driscoll評分低于空白組、BMSCs組、陰性對照組，實驗組改良Makin評分高于空白組、BMSCs組、陰性對照組，差異具有統計學差異，說明外泌體+絲素蛋白支架復合體可以對軟骨缺損部位進行更有效的修復。

綜上所述，Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯合絲素蛋白支架復合體可以對軟骨缺損部位進行有效的修復，可以為臨床上OA治療提供新的思路與方法。

[參考文獻]

[1]MANIAR K H， JONES I A， GOPALAKRISHNA R A. Lo`-wering side effects of NSAID usage in osteoarthritis： recent attempts at minimizing dosage[J]. ?Expert Opinion on Pharmacotherapy， 2018，19（2）：93`-102.

[2]GRAESSEL S， MUSCHTER D. Do neuroendocrine peptides and their receptors qualify as novel therapeutic targets in os`-teoarthritis[J]？ ?International Journal of Molecular Sciences， 2018，19（2）：367`-371.

[3]OSAWA Y， SEKI T， TAKEGAMI Y， et al. Cementless total hip arthroplasty for osteonecrosis and osteoarthritis produce similar results at ten years follow`-up when matched for age and gender[J]. ?International Orthopaedics， 2018，42（7， SI）：1683`-1688.

[4]HUI Tianqian， ZHOU Yachuan， WANG Tingyu， et al. Activation of beta`-catenin signaling in aggrecan`-expressing cells in temporomandibular joint causes osteoarthritis`-like defects[J]. ?International Journal of Oral Science， 2018，10（2）：13`-17.

[5]ZHANG Zhao， LI Xiaofei， HUANG Heng， et al. Cross`-coupling effects of silencing of cyclooxygenase`-2 （COX`-2）/aggrecanase`-1 and over`-expressed insulin`-like growth factor 1 （IGF`-1） in an osteoarthritis animal model[J]. ?Medical Science Monitor， 2017，23（7）：5302`-5310.

[6]馮笑，韓絮，張亞，等. 與軟骨細胞共培養促進BMSCs分化為軟骨細胞[J]. ?江蘇大學學報（醫學版）， 2017，27（5）：403`-407.

[7]阿勒泰別克·鬧乎旦，張玉玲，白廣超，等. Wnt因子聯合BMP`-7誘導BMSCs向成骨分化的研究[J]. ?石河子大學學報（自然科學版）， 2017，35（1）：113`-118.

[8]薄建成，張海寧，杜青峰，等. 介導pcDNA`-IGF`-1質粒轉染骨髓間充質干細胞兩種方法比較[J]. ?青島大學醫學院學報， 2016，52（5）：505`-507，511.

[9]王穎，張雷，周詠，等. miR`-21誘導犬BMSCs骨向分化的體外實驗研究[J]. ?安徽醫科大學學報， 2017，52（9）：1318`-1323.

[10]徐亮，陶樹清，文剛，等. RhoA/ROCK信號通路在骨質疏松大鼠BMSCs成骨分化中的研究[J]. ?中國骨質疏松雜志， 2017，23（11）：1415`-1419.

[11]亓俊華，吳梅，徐祥，等. TNF`-α對小鼠骨髓間充質干細胞免疫抑制作用影響[J]. ?青島大學醫學院學報， 2015，51（2）：169`-171，174.

[12]黃勇，吳華拉，馬琳，等. γ`-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路對BMSCs向肺泡上皮細胞分化的影響[J]. ?基因組學與應用生物學， 2017，36（5）：1727`-1731.

[13]陳能，邵云峰，劉儻，等. 帶部分松質骨小牛皮質骨復合骨髓間充質干細胞植入兔體內成骨及骨形態發生蛋白2的表達[J]. ?中國組織工程研究， 2017，21（17）：2684`-2689.

[14]劉天丹，張保朝，郝明亮. 膠原蛋白`-明膠復合支架材料修復周圍神經缺損[J]. ?中國組織工程研究， 2017，21（2）：286`-290.

[15]陶旋，李強，李詩鵬，等. 慢病毒介導人骨形態發生蛋白2/骨髓間充質干細胞/脫鈣骨基質修復股骨大段缺損[J]. ?中國組織工程研究， 2018，22（9）：1338`-1343.

[16]張志勇，于光屹，陶丹丹，等. 應用骨髓間充質干細胞復合關節軟骨脫細胞基質修復兔軟骨缺損的實驗研究[J]. ?中國醫藥指南， 2017，15（22）：53`-54.

[17]姜良斌，韋標方，馮志，等. 人脫細胞羊膜與骨髓間充質干細胞復合體修復關節軟骨缺損[J]. ?中國組織工程研究， 2017，21（26）：4113`-4118.

[18]SONG Jialin， ZHENG Wei， CHEN Wei， et al. Lentivirus`-mediated microRNA`-124 gene`-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation promotes the repair of spinal cord injury in rats[J]. ?Experimental and Molecular Medicine， 2017，49（5）：1`-9.

[19]AN Ke， LIU Huiping， ZHONG Xiaolong， et al. hTERT`-Immortalized bone mesenchymal stromal cells expressing rat galanin via a single tetracycline`-inducible lentivirus system[J]. ?Stem Cells Int， 2017， 2017：6082684.

[20]WANG Bangjun， LIAN Kai， LI Jun， et al. Restoration of osteogenic differentiation by overexpression of cannabinoid receptor 2 in bone marrow mesenchymal stem cells isolated from osteoporotic patients[J]. ?Experimental and Therapeutic Me`-dicine， 2018，15（1）：357`-364.

[21]DU Xiufan， HUANG Fangli， ZHANG Shujiang， et al. Carboxymethylcellulose with phenolic hydroxyl microcapsules enclosinggene`-modified BMSCs for controlled BMP`-2 release in vitro[J]. ?Artificial Cells Nanomedicine And Biotechnology， 2017，45（8）：1`-14.

[22]LU Yao， GAO Hui， ZHANG Man， et al. Glial cell line`-derived neurotrophic factor`-transfected placenta`-derived versus bone marrow`-derived mesenchymal cells for treating spinal cord injury[J]. ?Medical Science Monitor， 2017，23（1）：1800`-1811.

[23]ZENG Yanling， ZHENG Hao， CHEN Qiuru， et al. Bone marrow`-derived mesenchymal stem cells overexpressing MiR`-21 efficiently repair myocardial damage in rats[J]. ?Oncotarget， 2017，8（17）：29161`-29173.

[24]SUN Bingyin， ZHAO Baoxiang， ZHU Jieying， et al. Role of TGF`-beta 1 expressed in bone marrow`-derived mesenchymal stem cells in promoting bone formation in a rabbit femoral defect model[J]. ?International Journal of Molecular Medicine， 2018，42（2）：897`-904.

[25]ZHAO Na， ZENG Li， LIU Yang， et al. DLX3 promotes bone marrow mesenchymal stem cell proliferation through H19/miR`-675 axis[J]. ?Clinical Science， 2017，131（22）：2721`-2735.

[26]KAMERKAR S， LEBLEU V S， SUGIMOTO H， et al. Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer[J]. ?Nature， 2017，546（7659）：498`-503.

[27]PAN Lei， LIANG Wei， FU Min， et al. Exosomes`-mediated transfer of long noncoding RNA ZFAS1 promotes gastric can`-cer progression[J]. ?Journal of Cancer Research and Clinical Oncology， 2017，143（6）：991`-1004.

[28]GUO Shangchun， TAO Shicong， YIN Wenjing， et al. Exosomes derived from platelet`-rich plasma promote the re`-epithelization of chronic cutaneous wounds via activation of YAP in a diabetic rat model[J]. ?Theranostics， 2017，7（1）：81`-96.

[29]TAO Shicong， YUAN Ting， ZHANG Yuelei， et al. Exosomes derived from miR`-140`-5p`-overexpressing human synovial mesenchymal stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model[J]. ?Theranostics， 2017，7（1）：180`-195.