長鏈非編碼RNA DEANR1等在肺癌中的表達

張磊　何越峰　張莉　張騰飛　楊凱云　黃云超　譚慧

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR等在肺癌中的表達。 方法 選取2018年1～6月昆明醫科大學第三附屬醫院收治的54例肺癌患者，其中鱗癌、腺癌、肺小細胞癌分別為28、22、4例。經手術獲取癌組織、癌旁正常組織、肺癌淋巴結轉移組織，提取總RNA，并采用SYBR Green實時熒光定量PCR檢測基因的RNA表達量。 結果 DEANR1、INXS、ANCR在癌組織中的相對表達量均高于癌旁正常組織（P < 0.05）。淋巴結組織中ANCR、INXS的相對表達量與ki-67呈正相關（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。結論 DEANR1、INXS、ANCR在癌組織中的相對表達量均升高，可能在肺癌的發生發展中起到促進作用，ANCR、INXS在淋巴結中的表達與ki-67呈正相關，可能與肺癌淋巴結轉移及不良預后有關。

[關鍵詞] 肺癌;lncRNA;DEANR1;INXS;ANCR;FENDRR

[中圖分類號] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0009-03

Expression of long non-coding RNA DEANR1 and others in lung cancer

ZHANG Lei1 ? HE Yuefeng2 ? ZHANG Li1 ? ZHANG Tengfei1 ? YANG Kaiyun1 ? HUANG Yunchao1 ? TAN Hui1

1.The First Department of Thoracic Surgery， the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming ? 650500， China; 2.School of Public Health， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming ? 650500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA （lncRNA） DEANR1， INXS， ANCR， FENDRR in lung cancer. Methods The study included 54 patients with lung cancer admitted to the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January to June 2018， including squamous cell carcinoma， adenocarcinoma， and small cell lung cancer in 28， 22， 4 cases， respectively. The cancer tissue， the lymph node metastasis and the tissue adjacent to carcinoma of 54 cases of patients with lung cancer was used to detect the expression of these genes by the real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression levels of INXS and ANCR in cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression levels of ANCR and INXS in lymph node tissues were positively correlated with ki-67 （r = 0.757， P = 0.049; r = 0.802， P = 0.030）. Conclusion The increased expression of DEANR1， INXS and ANCR in cancer tissues may be a positive factor in the development of lung cancer. The expression of ANCR and INXS in lymph nodes is positively correlated with ki-67， which may be related to lymph node metastasis and poor prognosis of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; lncRNA; DEANR1; INXS; ANCR; FENDRR

肺癌在世界上發病率及死亡率一直居高不下，其發生發展與多個基因的表達密切相關，長鏈非編碼RNA（lncRNA）指的是一類轉錄本長度超過200 nt[1]但不編碼蛋白質的RNA分子，研究發現在腫瘤組織中有異常的lncRNA表達譜，其表達和功能的異常經常導致疾病的發生，如乳腺癌、肝癌、結直腸癌等[2-4]。

有研究發現lncRNA DEANR1在調節內胚層分化中有重要作用[5]。文獻[6]發現INXS在腎臟、肝臟、乳腺和前列腺腫瘤細胞系中含量比非腫瘤組織低5～9倍，揭示了INXS是誘導細胞凋亡的內源性lncRNA。在一項關于乳腺癌的研究中，發現ANCR基因在乳腺癌細胞中的表達較癌旁組織下調，ANCR抑制乳腺癌細胞的遷移和入侵，該基因可能是乳腺癌診斷及治療的標志物[7]。研究發現FENDRR能夠抑制非小細胞肺癌細胞（NSCLC）的惡性增殖[8]。肺癌作為人類死亡率最高的惡性腫瘤，筆者推測其中部分基因也可能與肺癌的增殖、凋亡、復發、轉移等某個方面相關。

本研究納入2018年1～6月昆明醫科大學第三附屬醫院（以下簡稱“我院”）收治的54例肺癌患者，經手術獲取標本，采用熒光定量PCR技術檢測肺癌組織、正常組織、縱隔淋巴結轉移組織中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表達量，通過與臨床觀察指標綜合分析，觀察其與肺癌的發生發展是否有關，為下一步研究lncRNA基因譜與肺癌發生發展的機制奠定一定的實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經我院醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書后，收集2018年1～6月我院胸外一科住院患者行外科手術切除的肺癌組織、癌旁正常組織及淋巴結轉移組織（正常組織與癌組織距離>3 cm），均經過病理確診。術后組織細胞學病檢結果出示后，確定組織分型，查詢并收集病例資料。共收集樣本54例，其中腺癌、鱗癌、小細胞癌分別為28、22、4例;年齡35～75歲，平均（55.86±8.67）歲;男38例，女16例;吸煙33例，占61.11%;飲酒22例，占40.74%;低、中、高分化程度分別為26、22、6例;P40有10例（-）、11例（+）;P63有15例（-）、12例（+）;TTF-1有15例（-）、13例（+）;CK7有10例（-）、11例（+）;ki-67（+）范圍為1%～80%。

納入標準：肺腫瘤患者經手術后取得組織學標本經病理確診為鱗癌、腺癌或小細胞肺癌。

排除標準：①肺腫瘤患者不能行手術者;②手術未能同時獲得癌組織、正常組織及淋巴結轉移組織。

1.2 組織的收集和保存

取下組織10 min內將標本放入預先裝有RNAlater（美國ambin公司，貨號JC-009）溶液的試管內，先在 -4℃環境中放置8 h，然后放入-80℃冰箱內長期保存。

1.3 RNA提取和定量

利用TRIzol（康為世紀）提取總RNA，天根生化Quant One Step RT-PCR kit（KR113）（貨號CW2569M）進行反轉錄，按說明書步驟操作。利用熒光定量檢測試劑盒（FP402）（天根生化，貨號CW0957M）對RNA進行實時熒光定量PCR，以β-actin作為內參，以-△△Ct值來表示組織中各個基因相對表達量。引物信息見表1。

1.4 統計學方法

統計數據后錄入數據庫，采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析進行三組之間的比較，使用LSD-t檢驗來比較任意兩組間的差異，5個基因相對表達量與ki-67的關系采用Spearman等級相關，與P63、CK-7等相關性采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織、癌旁正常組織與肺癌轉移淋巴結組織中lncRNA的表達

與正常組織比較，肺癌組織中DEANR1、INXS、ANCR的表達升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 基因的相對表達量與ki-67及CK-7、P63等臨床指標之間的關系

在肺癌組織中，CK-7陽性組中ANCR、FENDRR相對表達量[（8.15±4.23）、（16.00±5.54）]顯著高于CK-7陰性組[（16.00±5.54）、（13.43±2.14）]（P = 0.032、 0.025）;DEANR1在P63陽性組的表達量（10.28±1.29）顯著高于P63陰性組（9.25±3.79）（P = 0.035）。通過Spearman等級相關分析，發現淋巴結組織中ANCR、INXS的相對表達量與ki-67呈正相關（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。

3 討論

lncRNA對癌癥等疾病具有重要的治療潛力，其結構、表達是許多疾病發生發展的基礎[9]。目前，已有報道ANCR在骨肉瘤組織中高表達，ANCR的表達減少抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移[10]。在結直腸癌中，ANCR表達降低時，腫瘤細胞的侵襲能力顯著下降[11]，但ANCR在肺癌中的作用尚不清楚。本研究中ANCR在肺癌組織中的表達高于正常組織（P < 0.05），在肺癌組織中ANCR在CK-7陽性組的表達量高于陰性組（P < 0.05），而CK-7在鱗狀上皮中并不表達，主要用于腺癌的診斷，ANCR的表達量與ki-67呈正相關，ki-67與預后相關，是檢測惡性腫瘤細胞增殖情況及惡性程度、判斷肺癌預后的標志[12]。提示ANCR可能在肺癌的發生中起到癌基因的作用，并與肺癌淋巴結轉移及不良預后有關，但其機制還需深入探索。

DEANR1在內胚層分化的調節中發揮作用，但它是否在肺癌中發揮作用鮮見文獻報道。本研究中DEANR1在肺癌組織中的表達較正常組織高（P < 0.05），并且與免疫組化指標P63有關，P63參與癌細胞增殖分化，同時具有促進和抑制腫瘤生長兩種作用[13]，在肺癌淋巴結轉移組織中，P63陽性組的DEANR1表達量高于P63陰性組（P < 0.05），可能為今后本課題組進一步研究DEANR1在肺癌中的作用奠定基礎。

INXS被發現是具有凋亡作用的新型內源性lncRNA，其在腎臟、肝臟、乳腺和前列腺腫瘤細胞中的表達量比非腫瘤組織中低5～9倍，INXS可能是誘導細胞凋亡的內源性lncRNA[5]。本研究中，INXS在肺癌組織中的表達高于正常組織（P < 0.05），與上述研究不同，可能與組織來源不同有關，也可能其在肺癌細胞中發揮著不同的作用，但還需擴大樣本量進行進一步研究，在淋巴結組織中INXS的表達量與ki-67呈正相關（P < 0.05），有研究發現ki-67的陽性與惡性腫瘤的增殖、發展、轉移及預后高度相關[14]，與本研究結果一致，提示INXS可能與肺癌淋巴結轉移及不良預后有關，是癌癥治療中可能探索的靶點。

在肺癌相關研究中，FENDRR基因可能與非小細胞肺癌的發生和進展相關，但與轉移無明顯關系[15]。本研究中，FENDRR在各組織中的表達比較差異無統計學意義，但FENDRR在CK-7（+）組的表達量高于CK-7（-）組（P < 0.05），而CK-7陽性表達與乳腺、肺等組織腺癌的發生相關[16]，提示FENDRR可能與肺腺癌的發生有一定關系，但需進一步收集肺腺癌樣本進行研究。

綜上所述，本研究通過對肺癌組織、正常肺組織、肺癌淋巴結轉移組織中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表達量進行檢測，發現DEANR1、INXS、ANCR在肺癌組織中的表達上調，上述基因可能在肺癌的發生發展中起到促進作用，ANCR、INXS在淋巴結中表達與ki-67呈正相關，可能與肺癌淋巴結轉移及不良預后有關。上述基因的表達情況可為今后肺腫瘤的診斷、治療、預后評價提供新的思路。在今后的研究中，我們將擴大樣本量，針對與肺癌相關的基因，對不同病理分型的肺癌進行進一步病因及機制相關的研究。

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