miR-19a-3p靶向調控CCND1基因介導FrA-1/IL-6/Stat3信號通路對乳腺癌侵襲轉移的作用機制

陳秀迎，王洪遠

乳腺癌主要誘發因素為惡變內皮細胞增殖失控和癌細胞轉移[1]。既往研究已對microRNA展開深入研究，證實其既可發揮促癌作用亦存在抑癌作用[2]，且部分microRNA可同時兼具以上兩種作用[3]，在調節癌細胞生物學特性上具有顯著影響，因而在臨床診斷和腫瘤預測以及靶向治療方向作用明顯。大量研究已報道microRNA參與諸如頭頸部、消化道、泌尿生殖系統腫瘤等[4-6]，但其分子機制仍未全可知。miR-19a-3p作為抑癌基因，在前列腺癌、胃癌等中有相關報道[7，8]。同時，細胞周期蛋白CCND1在非小細胞肺癌、乳腺癌中為陽性表達[9，10]。鑒于此，本研究通過采集組織樣本和培養細胞系，基于與乳腺癌相關靶基因和信號通路的預測，探究miR-19a-3p靶向CCND1基因介導FrA-1/IL-6/Stat3通路對乳腺癌上皮間質轉化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集日照市婦幼保健院病理科2017-01至2018-07女性乳腺癌標本60例。年齡28～76歲，中位年齡56.2歲。所有樣本經醫院倫理委員會批準通過。標本離體后，一部分立即放入液氮冷凍，-80 ℃超低溫冰箱貯存備用；另一部分固定于1%中性甲醛溶液中，常規石蠟包埋，4 μm厚切片，保存備用。采用蘇木精伊紅染色法(HE染色)觀察乳腺癌組織及癌旁組織的病理學變化。

1.1.2 細胞及培養 選取人正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞株MCF7，均購自上海中科院細胞所。人乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞株MCF7均用含10%小牛血清、10 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養液(Gibco公司，USA)培養。常規培養過程中觀察細胞生長狀態，并依據實際情況進行換液操作。

1.1.3 人乳腺癌細胞轉染及分組 細胞處于對數期時，采用胰蛋白酶消化細胞常規培養，按轉染物不同分為：空白組(空白處理)、陰性對照組(陰性質粒)、siRNA-CCND1組(siRNA)、miR-19a-3p mimic組(mimic質粒)、miR-19a-3p mimic+ siRNA-CCND1組(共轉染)。轉染物miR-19a-3p mimic， siRNA-CCND1質粒均購自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 生物學數據庫檢索乳腺癌相關基因及信號通路 通過生物學數據庫檢索得到乳腺癌相關基因及相關代謝通路，分別確定為CCND1基因和FrA-1/IL-6/Stat3通路。在TargetScan數據庫檢索CCND1的調控miRNA為miR-19a-3p。

1.2.2 qRT-PCR檢測 取乳腺癌組織和癌旁組織，加TRIzol(Invitrogen公司，USA)經3000 r/min,離心10 min,取上清,提取總RNA；采用紫外光檢測RNA純度后將抽提的RNA進行反轉錄；反轉錄所得cDNA為PCR實驗模板，對目的基因進行定量PCR擴增；實時熒光定量PCR應用AB7300型實時定量PCR儀器(購于上海艾研生物科技有限公司，上海，中國)。本實驗以GAPDH作為內參照基因。PCR擴增完成后，通過比較Ct法統計實驗結果，此方法同樣適用于細胞實驗。

1.2.3 Western Blot檢測 待測組織加入冰上預冷的組織裂解液，置于冰上進行裂解；Bradford法測定蛋白濃度；實驗采用一抗為兔多克隆抗體CCND1、β-catenin、FrA-1；已標記二抗。Western blot所用抗體均購于abcam公司(劍橋，英國)。采用增強化學發光法檢測蛋白表達(ECL試劑盒；購于武漢博士德生物技術公司)。此方法同樣適用細胞蛋白表達水平檢測。

1.2.4 MTT實驗 按MTT常規操作程序，取對數生長期的細胞進行轉染和培養(培養觀察時間點為24 、48、96 h)，并依次加入各培養液繼續培養；并在培養結束前加入20 μl MTT溶液(Sigma公司，USA)，繼續培養4 h后棄上清并加入160 μl DMSO(Sigma公司，USA)。應用全自動酶標儀(濟南正榮醫療器械有限公司)測定各孔波長490 nm處的吸光值(OD值)。

1.2.5 細胞遷移和侵襲實驗 按劃痕實驗常規操作程序，取合適細胞株制備單細胞懸液，接種操作置于CO2培養箱(揚州恒都電子科技有限公司)常規培養24 h。之后應用高壓滅菌槍頭在貼壁細胞培養板孔板中心軸處劃痕。繼續培養，采用倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)觀察細胞情況并計算細胞相對遷移率。按Transwell侵襲實驗常規操作程序，分別于小室加入相應實驗液，37 ℃下培養24 h、離心及結晶紫染色，顯微鏡下觀察并在實驗后期進行貼壁細胞的計數。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織HE染色結果 乳腺癌癌旁正常結締組織較多，成纖維細胞増生，纖維間質稍有增生，但細胞無明顯異型性，分化較好；乳腺癌組織細胞排列混亂，癌細胞大量増生，癌巢中央可見大小各異的壞死、淋巴細胞浸潤，細胞發生分化，核深染，核分裂象增多，有明顯核仁(圖1)。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織病理結果(HE，×100)

2.2 人乳腺癌組織和癌旁組織中FrA-1/IL-6/Stat3通路相關基因mRNA和蛋白表達水平 qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，人乳腺癌組織中CCND1、FrA-1的mRNA和蛋白表達均呈高表達，其表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)；而qRT-PCR提示人乳腺癌組織中miR-19a-3p表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 人乳腺癌組織和癌旁組織中相關基因mRNA和蛋白表達水平差異

2.3 各組細胞轉染后相關基因的mRNA和蛋白表達水平 qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，空白組與陰性對照組差異無統計學意義。與空白組和陰性對照組相比，另外3組的miR-19a-3p、CCND1、FrA-1表達水平均上調，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1組中上調更為明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌各組細胞轉染后相關基因的mRNA和蛋白表達水平差異

2.4 miR-19a-3p靶向CCND1對乳腺癌細胞增殖的影響 MTT法觀察結果顯示，各組細胞在24 h時無明顯差異。48 h和96 h各組細胞增殖能力均提高。空白組與陰性對照組細胞增殖能力相比無明顯差異。另外三組的細胞增殖能力均明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)，但miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1組中細胞增殖變化趨勢較弱，差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

2.5 miR-19a-3p靶向CCND1對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響 空白組與陰性對照組細胞遷移、侵襲能力差異無統計學意義。與空白組和陰性對照組相比，另外三組細胞遷移、侵襲能力均減弱，差異有統計學意義(P<0.05)，且miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1組遷移、侵襲能力最弱，差異有統計學意義(P<0.05，表4)。

表3 miR-19a-3p靶向CCND1對乳腺癌各組細胞增殖能力變化的影響

表4 miR-19a-3p靶向CCND1對乳腺癌各組細胞遷移和侵襲能力變化的影響

3 討 論

Kong等[11]發現，miR-27a可通過負向調控SFRP1基因，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進乳腺癌細胞增殖遷移等。Imani S等[12]亦報道miR-34a靶向EMT-TFs，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。本研究選取高度保守microRNA，miR-19a-3p首先推斷其可能具有抑制癌細胞轉移的功能。根據前期臨床標本的PCR和Western blot證明了我們的初步假設；同時，CCND1基因是近年來已確認的癌基因，與人類腫瘤關系密切[13，14]，且已證實在乳腺癌中異常表達[15]。為進一步確認其上下游作用機制，本研究通過人體組織樣本和細胞系培養實驗，發現miR-19a-3p乳腺癌中表達下降，CCND1和Fra-1表達則呈上升趨勢；進一步細胞實驗驗證上升miR-19a-3p可有效抑制CCND1表達和Fra-1表達，抑制乳腺癌細胞侵襲轉移。本研究結果這一關聯機制的發現，提示miR-19a-3p可能通過靶向抑制CCND1，調控FrA-1/IL-6/Stat3信號通路，抑制FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，伴隨體外乳腺癌細胞實驗中侵襲轉移能力的下降，從腫瘤微環境上影響癌細胞發展進程。文獻[16]發現下調miR-19a-3p有助于通過激活TGF-β信號促進前列腺癌細胞的侵襲、遷移和骨轉移；張智勇等[8]發現miR-19a-3p可下降SEMA4C表達從而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲。類似研究進一步支持本文假設推理，有助于通過癌細胞轉染探究乳腺癌侵襲轉移分子機制，為乳腺癌分子靶向治療提供潛在實驗依據。

FrA-1/IL-6/Stat3信號通路是影響腫瘤相關巨噬細胞表型的主要通路之一，后者在腫瘤微環境中有巨大的潛能[17，18]。巨噬細胞具有極強的異質性和可塑性。在惡性競爭的腫瘤微環境中，巨噬細胞可形成其獨特表型，從而發揮促癌作用。本研究通過質粒轉染，以miR-19a-3p表達上升，抑制FrA-1表達。FrA-1已證實是一類原癌基因，在包括乳腺癌在內的眾多癌癥中異常表達[19]。提示其可作為乳腺癌靶向治療的重要靶點。我們推測FrA-1表達沉默可能進一步抑制巨噬細胞表型，干擾血管新生的形成，抑制下有信號通路，從而逆轉腫瘤細胞增殖等行為的改變。

總之，本研究創新之處在于通過借助生物信息學技術和分子生物學方法，尋找潛在癌癥相關靶點，確認miR-19a-3p可抑制CCND1基因表達和FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，降低乳腺癌細胞侵襲轉移。下一步研究可借助生物信息學技術，系統篩選其他與乳腺癌相關的信號通路和靶基因，并通過體內外研究及動物實驗探究靶基因相關眾多microRNAs的作用和功能，從而為乳腺癌靶向治療提供全面的分子生物學證據。