UGT1A1基因與伊立替康致結腸癌患者腹瀉及中性粒細胞減少的關系分析

陳 倫，陳霽暉，張 青，黃曉會，李莉霞，卜書紅

0 引言

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，好發于乙狀結腸和直腸交界處，有較高的發病率和病死率。研究認為，腫瘤發生為多基因的病理反應[1]。近年來，隨著分子遺傳學、基因組學的快速發展，相關研究發現，腫瘤細胞基因型不僅參與腫瘤分化、增殖及預后，還與癌細胞對化療藥物的敏感性相關，基因預測化療藥物毒副反應備受臨床關注[2]。伊立替康為中晚期結直腸癌的常用化療藥物，在肝臟內可快速水解為活性產物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，抑制DNA單鏈斷裂后修復，影響DNA復制及轉錄，引起腫瘤細胞凋亡，從而起到治療作用[3]。但SN-38主要通過尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶家族(UGTs)在肝臟中代謝，UGT1A1基因變異可降低UGT1A1表達，減少SN-38轉化，增加伊立替康所致的不良反應[4-5]。既往研究報道，UGT1A1基因多態性和伊立替康所致的腹瀉、中性粒細胞減少有一定關系[6]，但此結論尚存爭議。本研究旨在探討UGT1A1基因與伊立替康致結腸癌患者腹瀉及中性粒細胞減少的關系，從而指導臨床個體化用藥。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017年5月至2018年4月入院治療的60例結腸癌患者，入選標準[7]：均經病理組織活檢確診為結腸癌；心肝腎等功能無明顯異常；預計生存時間超過3個月；距離最近1次化療或者手術時間超過4周；有可測量病灶。排除標準：接受放療；其他惡性腫瘤病史；嚴重多器官功能障礙；消化道及黃疸梗阻；造血功能不全；妊娠或者哺乳階段；既往接受過伊立替康治療；本研究藥物過敏禁忌證。男36例，女24例；年齡36～74歲，平均(60.35±9.38)歲；低分化腺癌23例，中、高分化腺癌37例。

1.2 治療方法 患者入院后均采用伊立替康聯合氟尿嘧啶治療，靜脈滴注125～180 mg/m2伊立替康，第1天；靜脈滴注400 mg/m2氟尿嘧啶和亞葉酸鈣200 mg/m2，第1～2天，1 600 mg/m2靜脈泵注維持46 h，3周為1個周期，均治療2～4個周期，患者出現嚴重不良反應時，暫停給藥并給予對癥治療，待恢復至≤1級后再繼續治療，并將伊立替康劑量下調1個單位25 mg/m2。

1.3UGT1A1基因分型 收集患者治療結束時外周靜脈血3 ml，放置在抗凝管中，保存在-20 ℃低溫冰箱中待檢。取400 μl全血在2 ml離心管中，加入10 μl蛋白酶K、90 μl 10%異丙醇、410 μl STE溶液，搖晃2 min，放置在65 ℃水浴鍋中消化過夜。在充分消化血樣中加入300 μl飽和氯化鈉溶液，混勻后加入400 μl氯仿，混合均勻后在20 ℃環境中，在12 000 r/min離心機下離心20 min。將上清液轉移至1.5 ml離心管中，鍵入等體積的-20 ℃預冷異丙醇，混合均勻后，在4 ℃環境下離心15 min，除去上清液。在離心管中加入-20 ℃預冷75%乙醇溶液，按照以上離心條件離心15 min，去除上清液。并重復1次以上操作，室溫條件下晾干沉淀，加入100 μl Mili-Q水解液進行沉淀。取1 μl DNA樣本，取1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本質量，采用分光光度計測定樣本濃度及純度。取Mili-Q水稀釋樣本至10 ng/μl備用。參照Genbank的UGT1A1基因序列及配套軟件設計UGT1A1基因藥物遺傳多態性位點特異性引物(UGT1A1*28：rs8175347，UGT1A1*6：rs4148323)。全部引物均由配套試劑盒提供，引物母液濃度為100 μmol/L，稀釋所有引物為1～10 μmol/L備用。取人外周血DNA為模板進行PCR擴增反應，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物。用人外周血DNA為模板進行touch down PCR擴增，采用HRM方法進行測定，用Bipedit軟件進行序列比對，并分析基因類型。

第1步不提取DNA，第2步不進行擴增。取患者外周血2 ml，EDTA抗凝處理；采用北京華夏時代基因發展科技有限公司提供的測序反應通用試劑盒，并嚴格按照說明書操作。提取白細胞后，采用熒光檢測儀對UGT1A1*28(rs8175347)和UGT1A1*6(rs4148343)位點進行檢測。

1.4 藥物毒性評價標準 患者入院后均查閱病歷，記錄性別、年齡、ECOG評分、轉移器官數目等資料。每個化療周期后，均查閱患者血液學檢查、病史等。采用美國國家研究所不良反應分度標準4.0[8]評估患者化療后腹瀉、中性粒細胞減少情況，包含0～4級。①腹瀉。0級：無，1級：大便次數每天增加2～3次，2級：大便次數每天增加4～6次或者中度腹痛、夜間大便，3級：大便每天增加7～9次或者嚴重腹痛或者大便失禁，4級：大便每天增加10次或者需腸外支持治療或者明顯血性腹瀉。②中性粒細胞減少。0級：中性粒細胞≥2.0×109/L；1級：中性粒細胞1.5×109/L～1.9×109/L；2級：中性粒細1.0×109/L～1.4×109/L；3級：中性粒細胞0.5×109/L～0.9×109/L；4級：中性粒細胞<0.5×109/L。其中3、4級為嚴重不良反應。

1.5 統計學分析 數據處理采用SPSS 18.0軟件包，計數資料用率(%)表示，數據比較采用χ2檢驗，單因素分析有意義的因素用Logistic回歸方程進行多因素分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細胞減少的關系UGT1A1*28、UGT1A1*6突變基因型患者腹瀉、中性粒細胞減少發生率均分別高于野生型患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的單因素分析 單因素分析顯示，結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少0～4級患者在不同性別、年齡、轉移器官數目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量中比較差異有統計學意義(P<0.05)；在不同ECOG評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、表3。

2.3 結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的Logistic回歸分析 將可能導致嚴重腹瀉、中性粒細胞減少的性別、年齡、轉移器官數目、UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量等因素納入Logistic回歸方程進行分析，結果顯示，UGT1A1*28基因型、UGT1A1*6基因型、伊立替康劑量是結腸癌患者伊立替康致腹瀉、中性粒細胞減少的獨立危險因素，見表4、表5。

3 討論

結腸癌是嚴重危及患者生命安全的惡性腫瘤，近年來，隨著人們生活環境、飲食習慣的改變，其發生率呈上升趨勢。結腸癌的早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現，多數患者糾正時已為中晚期，化療是此類患者的重要治療手段。

伊立替康為半合成的可溶性喜樹堿衍生物，主要作用于細胞周期S期，通過抑制拓撲異構酶Ⅰ，代謝為SN-38，影響DNA復制及細胞分裂，導致腫瘤細胞死亡[9-10]。盡管伊立替康在結腸癌治療中的效果已得到研究證實[11-12]，但隨著其在臨床的廣泛應用，其所致的腹瀉及中性粒細胞減少等不良反應較為突出，限制其使用。機體肝細胞內SN-38在UGT1A1作用下轉化為SN-38G，通過膽汁排泄至腸道后，在β-葡萄糖醛酸酶作用下轉化為SN-38，血液及腸道中高濃度的SN-38又增加血液學毒性風險，增加腸壁炎癥細胞滲透性，促進水及電解質的分泌，導致內環境改變，腸道內菌群失調，從而引起腹瀉[13-14]。UGT1A1又可促進SN-38轉化為SN-38G，從而減輕其不良反應。侯慧軒等[15]研究發現，中國患者出現伊立替康致嚴重不良反應的發生率較歐美國家低，此差異一方面可能和國內化療劑量有關，另一方面，有研究報道，UGT1A1基因多態性分布有明顯的種族差異，可能導致伊立替康在不同個體中的毒性反應存在差異[16]。因此，分析UGT1A1基因多態性和伊立替康不良反應間的關系有重要價值。

UGT1A1基因位點有多種突變，其中UGT1A1基因第28位點的啟動子區TATA盒中的TA數目重復疊加差異可影響此基因多態性，TA插入延長或者減少縮短均可減少UGT1A1基因合成，影響酶功能[17]。TA6/TA6是UGT1A1*28基因最常見的野生基因型，啟動子區其次重復的主要為TA6/TA7雜合突變型。UGT1A1*6基因是由UGT1A1第一外顯子211位點出現單核苷酸替換所致，主要為野生型及雜合突變型，作用上和UGT1A1*28基因相似，能夠調控UGT1A1基因活性，此基因突變能夠降低患者對SN-38的代謝能力[18]。

表1 UGT1A1不同基因型和伊立替康致腹瀉及中性粒細胞減少的關系(例，%)

表2 結腸癌患者伊立替康致腹瀉的單因素分析(例，%)

表3 結腸癌患者伊立替康致中性粒細胞減少的單因素分析(例，%)

表4 結腸癌患者伊立替康致腹瀉的Logistic回歸分析

表5 結腸癌患者伊立替康致中性粒細胞減少的Logistic回歸分析

陳茹等[19]研究報道，UGT1A1基因多態性可增加伊立替康治療結腸癌患者腹瀉、中性粒細胞減少的危險性。本研究結果顯示，UGT1A1*28基因、UGT1A1*6基因型和嚴重腹瀉、中性粒細胞減少患者有良好相關性，以上基因突變型患者腹瀉的發生率明顯高于野生型，同時Logistic回歸分析發現，性別、年齡、轉移器官數目和嚴重腹瀉、中性粒細胞減少的發生無關，排除了其對伊立替康所致毒性反應的影響，進一步說明UGT1A1基因多態性和腹瀉的關系。臨床治療實踐中，不可避免地根據患者自身經濟、個人體質等調整伊立替康劑量，可能影響伊立替康所致不良反應，既往已有研究報道，伊立替康不良反應受化療劑量的影響[20]，本研究也支持此結論，因此，臨床應綜合考慮UGT1A1*28、UGT1A1*6的影響。但本研究未進一步分析伊立替康劑量和UGT1A1的關系，加上樣本量缺乏代表性，因此UGT1A1基因型和伊立替康劑量的關系認識尚需大樣本研究證實，加上性別、年齡、轉移器官數目等因素可能存在一定的交互影響，進一步分析各個因素之間的相關性，得出的結果可能更加可靠。

綜上所述，UGT1A1基因與伊立替康所致結腸癌患者腹瀉及中性粒細胞減少有關，可為臨床伊立替康不良反應的干預及用藥選擇提供理論依據。