RP-HPLC同時測定治胃丸中2種有效成分含量

汪 杰，黃祖光，陳煥擂

0 引言

治胃丸是我院院內(nèi)制劑，由陳皮、白芍、枳實、木香、砂仁、元胡、柴胡、郁金、甘草、木蝴蝶、黃芩、延胡索組成，臨床上主要用于治療各型胃炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等癥，具有行氣解郁、和胃止痛的功效。方中陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[1]。白芍用于腹痛、血虛萎黃、頭暈目眩等癥，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、平抑肝陽的功效[2]。目前，治胃丸的質(zhì)量標準中缺少含量測定項，難以保障臨床用藥的有效性。研究表明，陳皮、白芍的主要活性成分橙皮苷、芍藥苷具有與該復方制劑功能相關(guān)的藥理活性[3-4]。因此，本研究建立反相高效液相色譜(Reversed-phase high performance liquid chromatogr，RP-HPLC)法同時檢測治胃丸中橙皮苷、芍藥苷的含量，旨在為提高其質(zhì)控水平提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 治胃丸(本院制劑，規(guī)格：42 g/瓶)，橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201316)，芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201337)，水為重蒸水。乙腈、甲醇、碳酸均來自德國merck公司，其中乙腈為色譜純，甲醇和碳酸為分析純。

1.2 儀器 日本島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司，儀器配置：LC-20A高壓泵，CTO-20A柱溫箱，DGU-20A5脫氣機，SPD-M20A 二極管陣列紫外檢測器，LC-solution色譜工作站)，AEG-220型電子分析天平(日本島津儀器有限公司)，KQ-300型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz)，Synergi Hydro-RP C18色譜柱(廣州菲羅門科技儀器有限公司，250 mm×4.6 mm，4 μm)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Synergi Hydro-RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，以乙腈為流動相A，0.1%碳酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序：0～40 min，15%→25%(A%)，85%→75%(B%)，流速：1.0 ml/min，檢測波長230 nm，進樣量10 μl，柱溫35 ℃。

2.2 對照品儲備溶液的制備 精密稱取適量橙皮苷對照品，加甲醇制成0.2 mg/ml的橙皮苷對照品溶液(每1 ml溶液含橙皮苷0.2 mg)；另精密稱取適量芍藥苷對照品，加甲醇制成0.1 mg/ml芍藥苷對照品溶液(每1 ml溶液含芍藥苷0.1 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取適量治胃丸，研細，精密稱取細粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，并稱重。超聲處理30 min，室溫放冷后，再次稱重，用甲醇補重，濾過，去濾過液，過0.45 μm微孔濾膜，供試品溶液制備完成。按處方比例分別稱取除橙皮、芍藥以外的其余藥物，按照治胃丸制作方法分別制作不含橙皮與不含芍藥的丸劑，按照治胃丸供試品溶液制備方式制備出無橙皮對照品溶液與無芍藥對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取橙皮苷對照品溶液、芍藥苷對照品溶液、治胃丸供試品溶液、無橙皮對照品溶液及無芍藥對照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項中色譜條件進行測定，記錄色譜圖。圖譜顯示，治胃丸供試品溶液色譜圖中橙皮苷、芍藥苷色譜峰保留時間與橙皮苷、芍藥苷對照品溶液中基本一致，且無橙皮對照品溶液與無芍藥對照品溶液無干擾。見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述配制好的橙皮苷對照品溶液1、3，5、8、10、12 ml分別置入25 ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。稀釋后橙皮苷質(zhì)量濃度分別為：8、24、40、64、80、96 μg/ml；另精密吸取芍藥苷對照品溶液0.25、1、1.5、2.5、3.5、4 ml，分別置入25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋。芍藥苷質(zhì)量濃度分別為：1、4、6、10、14、16 μg/ml。分別精密吸取各對照品稀釋后溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項中色譜條件進行測定。分別以橙皮苷、芍藥苷峰面積(Y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(X)繪制標準曲線(線性回歸法)，并計算回歸方程。結(jié)果橙皮苷質(zhì)量濃度在8.35～83.52 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，芍藥苷質(zhì)量濃度在1.51～15.1 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n=6)

圖1 反相高效液相色譜圖

2.4.3 精密度試驗 精密吸取橙皮苷對照品溶液和芍藥苷對照品溶液，分別按“2.1”項中色譜條件重復進樣6次，每次進樣量10 μl，觀察并記錄橙皮苷、芍藥苷色譜峰的峰面積，并計算各峰面積的RSD。結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD為0.86%，芍藥苷峰面積的RSD為1.8%，顯示儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取治胃丸供試品溶液，分別于0、4、10、12、24 h注入高效液相色譜儀，每次進樣量10 μl，按“2.1”項中色譜條件進行測定，分別記錄橙皮苷、芍藥苷峰面積，并計算各峰面積的RSD。結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD為1.2%，芍藥苷峰面積的RSD為1.5%，顯示治胃丸供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一批號的治胃丸供試品(批號：170502)共6份，按“2.3”項中供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項中色譜條件進樣分析，計算治胃丸中橙皮苷、芍藥苷峰面積的RSD。結(jié)果治胃丸中橙皮苷峰面積的RSD為1.4%，芍藥苷峰面積的RSD為1.9%，顯示該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已提前測定橙皮苷、芍藥苷含量的治胃丸樣本6份，分別研細，精密稱定細粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中。分別加入適量橙皮苷、芍藥苷對照品，按“2.3”項中方法制備供試品溶液，按“2.1”項中色譜條件進樣分析，分別記錄橙皮苷、芍藥苷色譜峰的峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，該方法準確度高。見表2。

2.5 樣品測定 取6個不同批號治胃丸供試品，分別按“2.3”項中方法制備供試品溶液，按“2.1”項中色譜條件進樣檢測，測定各批號治胃丸供試品中橙皮苷、芍藥苷的含量，每個樣本進行3次重復，以標準曲線法計算橙皮苷、芍藥苷的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測指標的選擇 橙皮苷是一種黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、祛痰平喘、保護心血管系統(tǒng)等多種藥理活性[5-6]。動物模型實驗表明，橙皮苷可通過促進大鼠胃泌素分泌，抑制乙酰膽堿、血管活性腸肽等分泌，促進胃腸運動，是陳皮發(fā)揮促胃腸動力的主要藥效成分之一[7]。芍藥苷具有鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、抗應激性潰瘍、擴張冠脈血管、對抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面的作用，是白芍柔肝解郁功效的主要有效成分之一[8-9]。研究表明，在胃痛、咳嗽等病癥處方中常采用陳皮與白芍、枳殼等配伍發(fā)揮藥效協(xié)同作用[10-11]。因此，選取橙皮苷和芍藥苷作為治胃丸質(zhì)量控制的檢測指標。

表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

3.2 供試品溶液制備條件考察 本研究在樣品提取過程中分別考察了甲醇、水、乙醇、50%乙醇和70%甲醇等溶劑對提取率的影響，結(jié)果甲醇提取率高，效果最好。同時比較了回流提取和超聲提取2種提取方法，結(jié)果超聲提取操作簡便，提取效果最佳。因此最終確定以甲醇為提取溶劑進行超聲處理30 min，提取完全且提取液易處理。

3.3 色譜條件考察 本研究在實驗過程中參考相關(guān)文獻報道分別考察了甲醇-0.5%冰醋酸水溶液(64∶36)[12]、乙腈-水(20∶80)[13]、甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)[14]等流動相系統(tǒng)的梯度洗脫效果，結(jié)果分離度均達不到要求。而采用乙腈-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫[15]，橙皮苷和芍藥苷的色譜峰拖尾因子(T)均符合要求，能明顯改善待測色譜峰的分離度。此外，本文還考察了多種型號的反相硅膠色譜柱，結(jié)果采用Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)柱干擾峰少，取得了良好的分離效果。

3.4 含量測定結(jié)果分析 本研究按照上述試驗條件檢測了不同批號治胃丸樣品中橙皮苷、芍藥苷的含量，結(jié)果橙皮苷平均含量5.6 mg/g，芍藥苷平均含量1.6 mg/g，且各批號樣品之間差異不明顯。因此，筆者建議將橙皮苷、芍藥苷的含量測定限度規(guī)定為每1 g治胃丸中橙皮苷、芍藥苷的含量分別不低于4.5 mg/g、1.3 mg/g(下浮20%)。

綜上所述，本研究建立的RP-HPLC方法操作簡便、快速，重復性好，可作為治胃丸的定量檢測方法。考慮到治胃丸處方中藥味眾多，今后還應建立其他成分含量測定的方法，以進一步提高、完善治胃丸的質(zhì)量標準，確保藥品質(zhì)量穩(wěn)定可控。