鯡辣椒中益生細菌的計數與分離鑒定及功能研究

王琦　張紫娟　羅艷萍　黃承婷　何溢昕　胡俊升　凌潔玉

摘要為獲得優良的益生菌株，在鯡辣椒發酵過程中對其芽孢桿菌及乳酸菌進行計數。結果表明，其均在第4天達到最高值。從該時期共分離得到9株芽孢桿菌與10株乳酸菌，其中蠟樣芽孢桿菌與植物乳桿菌占優勢。5株芽孢桿菌對龍蝦殘餌降解研究表明，B1與B18這2株蠟樣芽孢桿菌在48h對殘餌中淀粉降解率都高達60%以上，對蛋白的降解率達到50%以上，是凈水的優良候選菌株。4株乳酸菌體外抗氧化研究表明，L1乳酸乳球菌乳酸亞種產酸最強，而抗氧化活性也最高，且含有豐富的胞外多糖，可作為發酵乳制品的候選菌株。

關鍵詞 鯡辣椒;芽孢桿菌;乳酸菌;分離鑒定;殘餌降解;抗氧化

中圖分類號 S641.3;TS255.3

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）07-0199-02

鯡辣椒是流行于湖北、湖南、四川等省山區的一種傳統佐餐食品，它以玉米粉配以新鮮紅辣椒，經過15～30d的自然發酵而制成。隨著旅游業的發展，鯡辣椒開始進人大眾視野并以其獨特風味受到消費者的歡迎。到目前為止，關于鯡辣椒的研究報道并不多，已經有少量研究表明，其在發酵過程中的微生物菌群包括乳酸菌、芽孢桿菌醋酸桿菌和酵母菌等"，但是極少進一步對這些菌進行分離鑒定和益生作用分析。同眾多發酵食品，鯡辣椒是益生菌的天然來源e，因而本研究對鯡辣椒發酵過程中的芽孢桿菌和乳酸菌進行計數和分離鑒定，并且選取代表性菌株對其益生功能進行了初步探索，以期獲得優良的益生菌株，用于食品以及環保等領域。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮玉米粉紅辣椒姜蒜、食鹽等鯡辣椒制備原料，均購于正規超市;龍蝦配合飼料購于湖北濮陽飼料有限公司。

MRS培養基、芽孢桿菌計數培養基購于青島海博生物技術有限公司;rTaq聚合酶dNTP購于TaKaRa公司;DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;DPPH、焦性沒食子酸、水楊酸、30%過氧化氫、碘、硝酸鈣、考馬斯亮藍G-250等化學試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

引物序列由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其中乳酸菌的擴增引物為27F（5一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）與1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）;芽孢桿菌的擴增引物為16sF（5'-TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3'）與16sR（5'-CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3'）。

1.2試驗方法

1.2.1鯡辣椒的制備。按照農家常規做法，將新鮮紅辣椒洗凈切碎，與玉米粉以1：5混勻，加入適量的鹽姜、蒜，裝壇液封，于25C恒溫發酵16d。

1.2.2益生菌計數及分離鑒定在鯡辣椒發酵過程中，每隔4d取樣分別進行芽孢桿菌和乳酸菌計數。芽孢桿菌采用專用的芽孢桿菌計數培養基，379C培養48h;乳酸菌采用MRS瓊脂培養基，37C厭氧培養72h。

對發酵第4天的計數平板，挑取典型菌落，純化2代直至鏡檢形態一致，挑取單菌落進行液體培養，并提取其DNA，采用PCR擴增其16SrDNA。芽孢桿菌PCR條件為：949C預變性5min;94C變性30s，65C退火30s，72°C延伸1min，30個循環;72°C延伸7min。乳酸菌PCR條件為：94C預變性5min;94C變性1min，53C退火1min，72C延伸1.5min，30個循環;72C延伸10min。PCR產物送于武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，測序結果于NCBI數據庫進行序列比對。

1.2.3芽孢桿菌對殘余餌料降解的研究。將同時具有淀粉酶活與蛋白酶活的芽孢桿菌，采用牛肉膏蛋白胨培養基活化2代，以5%接種量接種到模擬龍蝦殘余餌料培養基8（1g龍蝦飼料加人100mL蒸餾水，121C滅菌25min，靜置，過夜后使用），28C振蕩培養，于48、72h取樣，分別測定其淀粉及蛋白質的含量，以未接菌的餌料培養基作為對照。淀粉含量測定采用碘顯色法+，蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[4。

1.2.4乳酸菌的體外抗氧化研究。選擇產酸較強的乳酸菌株接種于MRS液體培養基，活化2代，取其發酵上清液進行抗氧化性研究和胞外多糖提取。羥自由基（·0H）、DPPH自由基（DPPH·）與超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定，以吸胞外多糖的提取和測定均參照楊晨璐等的方法。

2結果與分析

2.1鯡辣椒發酵過程中芽孢桿菌、乳酸菌數量變化及分離鑒定

在鯡辣椒發酵過程中，每隔4d對其芽孢桿菌及乳酸菌進行計數。由圖1可知，芽孢桿菌數量在整個發酵期間變化較小，維持在1x104CFU/g左右，在第4天略高。而乳酸菌數量急劇上升，從初始8x103CFU/g上升到第4天的最高值1.5x10*CFU/g。芽孢桿菌能產生淀粉酶、蛋白酶等多種胞外酶類，將原料中的淀粉、蛋白質等分解成更易吸收的小分子糖類、多肽、氨基酸等物質，賦予了鯡辣椒更高的營養價值;而乳酸菌發酵產生乳酸，使鯡辣椒具有柔和的酸味，且和其他菌共同作用產生醛酮、醇等物質，賦予鯡辣椒獨特的風味"。

已有研究選用發酵完成的成品對鯡辣椒中乳酸菌進行分離鑒定凹，為了更廣泛地挖掘益生菌株，在計數結果最高的4d進行芽孢桿菌和乳酸菌的分離鑒定。經形態學鑒定和16SrDNA鑒定，共得到9株芽孢桿菌，其中蠟樣芽孢桿菌最多，其次是解淀粉芽孢桿菌;共得到10株乳酸菌，其中3株乳球菌，7株乳桿菌。由表1可知，在鯡辣椒發酵前期，蠟樣芽胞桿菌與植物乳桿菌為優勢菌群。

2.2芽孢桿菌對龍蝦殘餌降解的影響

產酶平板初篩結果表明，芽孢桿菌B1、B4、B18、B29、B30均同時具有較好的淀粉酶和蛋白酶活性。目前，對益生芽孢桿菌產酶的應用，集中在將其作為飼料添加劑，以提高動物對飼料的利用率4。但實際上，這些酶同樣可以作用于殘余飼料，如在水產養殖中，用于降解殘余餌料，從而降低養殖水體的有機物污染，目前相關研究較少B。

小龍蝦是湖北省重點養殖的淡水鰲蝦，其養殖水溫與鯡辣椒的發酵溫度相差較小，故人工模擬龍蝦養殖水體中殘餌濃度，研究這些芽孢桿菌對龍蝦飼料中淀粉及蛋白質的降解情況。由圖2、3可知，5株芽孢桿菌對殘餌中的淀粉均有較強的降解能力，除B30降解速度較緩慢外，其他4株菌在48h的降解率均達到60%以。上。對殘餌中蛋白質的降解，B4與B29較弱，而其他3株菌都達到50%以，上。綜合來看，B1與B18這2株蠟樣芽孢桿菌對淀粉及蛋白質的降解率均較高，且作用迅速、穩定，是較優良的候選菌株。

2.3乳酸菌體外抗氧化性

鈣溶圈大小表明，L1、L8、L30、L31這4株乳酸菌產酸較高，對這4株菌進行了體外抗氧化能力的初步研究和胞外多糖含量測定，結果如表2所示。

4株乳酸菌的發酵液對3種自由基都具有一定的清除能力，其中對·OH清除能力最突出，均達99%以上，高于1mg/mLVc的清除率。L1乳酸乳球菌乳酸亞種對DPPH.及02.也表現出更高的清除活性，抗氧化性良好，因其在4株菌中產酸也最高，故可作為發酵乳制品等產品的優良候選菌株。從表2還可以看出，4株乳酸菌胞外多糖含量均大于200μg/mL。眾多研究表明，胞外多糖能增加發酵乳制品的黏度和穩定性0，并能夠發揮抗氧化和抑菌等功能。

3結論與討論

發酵食品是益生菌的天然來源，鯡辣椒作為較獨特的發酵谷物制品，其所含益生菌值得探究。本試驗從發酵第4天的鯡辣椒中共分離得到9株芽孢桿菌和10株乳酸菌，是首次從鯡辣椒中進行芽孢桿菌的分離鑒定。

5株芽孢桿菌對模擬龍蝦殘餌均有一定的降解能力，其中B1與B18對淀粉的降解率均達到60%以上，對蛋白的降解率均達到50%以上，且作用穩定、迅速，是較優良的凈水候選菌株。傳統鯡辣椒發酵溫度通常在25～30C之間，且其原料玉米與水產飼料都是富含淀粉和蛋白質等有機物，因而其中的芽孢桿菌可能適合用于養殖水體的凈化。這只是前期的一個模擬研究，其芽孢桿菌是否適于在真正的龍蝦養殖水體中生長8，是否對水體污染的直接指標如化學需氧量、氨氮和亞硝氮等有改善作用，有待于后期進一步研究。

采用4株產酸較強的乳酸菌進行體外抗氧化研究表明，產酸最強的LI乳酸乳球菌乳酸亞種對DPPH·、·0H和O2-·均具有較高的清除率，尤其對.OH清除能力高于1mg/mL的Ve，且含較高量的胞外多糖，可作為發酵乳制品等產品的優良候選菌株。

總體而言，鯡辣椒中益生菌含量豐富，不僅該產品本身因受益生菌作用而風味獨特、營養豐富，還能從中發掘出許多益生菌株用于其他食品或環境保護等領域。

4參考文獻

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