白僵菌多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞作用的研究

宋志強(qiáng)　丁祥　朱淼　唐賢　侯怡鈴

摘要本文通過使用酶標(biāo)儀檢測(cè)白僵菌多糖刺激B淋巴細(xì)胞和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT后分別得到的OD值，對(duì)白僵菌多糖在機(jī)體免疫活性和抗腫瘤方面的作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，用不同濃度的白僵局多糖刺激B淋巴細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增加，成團(tuán)量變大;用不同濃度的白僵菌多糖刺激CT26.WT細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少或有被抑制的趨勢(shì)。由此說明，白僵菌多糖能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，抑制CT26.WT細(xì)胞的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 白僵菌;多糖;B淋巴細(xì)胞;CT26.WT細(xì)胞

中圖分類號(hào) R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）07-0187-02

白僵菌（Beauweria?bassiana）是一種病原真菌類的蟲生真菌，具有較強(qiáng)的抗蟲害作用，并且容易人工培養(yǎng)，主要用于害蟲的防治16。真菌多糖是真菌中的有效生物活性成分，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，并在抗腫瘤方面發(fā)揮出一定的積極作用17-8。

目前，對(duì)于白僵菌多糖的報(bào)道僅見于芽生孢子內(nèi)的糖原及其代謝的檢測(cè)，然而與白僵菌多糖對(duì)免疫活性的調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用相關(guān)的研究尚未見報(bào)道%。本試驗(yàn)通過使用不同質(zhì)量濃度的白僵菌多糖溶液分別刺激B淋巴細(xì)胞和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT，并結(jié)合酶標(biāo)儀檢測(cè)白僵菌多糖對(duì)B淋巴細(xì)胞和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT的影響，為進(jìn)一步研究白僵菌多糖對(duì)機(jī)體免疫功能和抗腫瘤功能的影響提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料。白僵菌（保存于西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）;B淋巴細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT26.WT）（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）;96孔板、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶[康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司]。

1.1.2藥品試劑。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Gibeo公司）;脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，上海源葉生物科技有限公司）;CCK-8試劑盒（cell?counting?kit-8，上海博升生物科技有限公司）;PBS緩沖液。

1.1.3主要儀器。Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)基因有限公司）;SE-CJ-1F型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;3100系列CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）;LD4-2A型離心機(jī)、BCD-208K/A型-80C冰箱（青島海爾股份有限公司）;HHS型水浴鍋（上海光地儀器設(shè)備有限公司）;Eppendorf移液槍[艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制。配制質(zhì)量濃度為1mg/mL的白僵菌多糖母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、30.00μg/mL的白僵菌多糖溶液。配制質(zhì)量濃度為1mg/mL的LPS母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的LPS溶液。

1.2.2B淋巴細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞的培養(yǎng)。用培養(yǎng)液將B淋巴細(xì)胞和CT26.WT細(xì)胞稀釋至2x10%細(xì)胞/mL，配制成細(xì)胞懸浮液。向96孔板樣品孔四周加入PBS緩沖液，其余孔中分別加人細(xì)胞懸浮液。試驗(yàn)設(shè)置為空白對(duì)照組、LPS陽(yáng)性對(duì)照組（終質(zhì)量濃度5μg/mL）和白僵菌多糖試驗(yàn)組（終質(zhì)量濃度0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、15.000μg/mL），在37C、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.3白僵菌多糖刺激B淋巴細(xì)胞CT26.WT細(xì)胞。向96孔板的空白對(duì)照組、試驗(yàn)組（終質(zhì)量濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、15.000μg/mL）和LPS陽(yáng)性對(duì)照組（終質(zhì)量濃度為5μg/mL）中分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液和質(zhì)量濃度為1.25、2.50.5.00、10.00、20.00、30.00μg/mL的白僵菌多糖溶液以及質(zhì)量濃度為10μg/mL的LPS溶液，每個(gè)濃度梯度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。充分混勻后放在37C、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h。

1.2.4酶標(biāo)儀檢測(cè)。將培養(yǎng)24h后的細(xì)胞從恒溫培養(yǎng)箱中取出，并分別取5μLCCK-8試劑加入96孔板內(nèi)，在37C、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3h，再用酶標(biāo)儀在450nm的激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值并記錄作圖。

2結(jié)果與分析

2.1白僵菌多糖對(duì)B細(xì)胞的增殖作用

由圖1可知，當(dāng)白僵菌多糖的終質(zhì)量濃度為0.625～15.000μg/mL時(shí)，能夠明顯看出B細(xì)胞呈現(xiàn)增殖狀態(tài)。當(dāng)終質(zhì)量濃度為5μg/mL，促進(jìn)B細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對(duì)照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

B淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)如圖2所示，從圖中可以看出，具有良好生長(zhǎng)狀態(tài)的B細(xì)胞加入白僵菌多糖刺激后，B細(xì)胞成團(tuán)量變大，增殖能力逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)用5μg/mL濃度的白僵菌多糖刺激B細(xì)胞時(shí)，B細(xì)胞的成團(tuán)量最大且增殖效果最好。

2.2白僵菌多糖對(duì)CT26.WT細(xì)胞的抑制作用

由圖3可知，當(dāng)白僵菌多糖的終質(zhì)量濃度為0.625～15.000μg/mL時(shí)，能夠明顯看出小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT的生長(zhǎng)被抑制了。當(dāng)終質(zhì)量濃度為2.500μg/mL時(shí)，抑制CT26.WT細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對(duì)照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

3結(jié)論

B淋巴細(xì)胞作為人體免疫重要的一道防線，可正向調(diào)節(jié)各種免疫成分和機(jī)體的免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的免疫活性調(diào)節(jié)發(fā)揮作用10-1。CT26.WT細(xì)胞則是以N-nitroso-N-methylu-rethane-（NMU）誘導(dǎo)BALB/C小鼠形成的未分化結(jié)腸癌細(xì)胞，CT26.WT細(xì)胞具有極強(qiáng)的侵襲性，對(duì)機(jī)體免疫會(huì)產(chǎn)生較大的危害13。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，白僵菌多糖在0.625～15.000μg/mL的濃度范圍內(nèi)，均能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，且增殖效應(yīng)與白僵菌多糖的質(zhì)量濃度成正相關(guān)。濃度為0.625～5.000μg/mL的白僵菌多糖試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異（P<0.01）。

白僵菌多糖在0.625～15.000μg/mL的濃度范圍內(nèi)，均能夠抑制CT26.WT細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，且抑制效應(yīng)與白僵菌多糖的質(zhì)量濃度成正相關(guān)。濃度為2.5μg/mL的白僵菌多糖試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異（P<0.01）。

綜上所述，在體外試驗(yàn)中一定濃度的白僵菌多糖能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，抑制CT26.WT細(xì)胞增殖，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用，但涉及的相關(guān)免疫機(jī)制、腫瘤機(jī)制及分子信號(hào)通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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