探討TNF-α、IL-6對體外培養胎鼠成骨細胞中串珠素表達的影響

翟連鎖，李琳，趙桂芳

（濟南市濟陽區人民醫院，山東 濟南 251400）

骨具有強大的修復、再生功能，在骨折愈合過程中，成骨細胞主要合成骨基質，起著非常重要的作用。TNF-α、IL-6等細胞因子具有多種生物學功能，在骨折愈合中是很強的骨吸收刺激因子，可以促使破骨細胞分化形成。此外，有大量研究顯示，TNF-α、IL-6會抑制成骨細胞，進而影響骨折的愈合，但是其確切機制還未研究清楚。串珠素（也叫基底膜蛋白多糖）可影響細胞和基質間的粘附，在軟骨發育、血管生成中起著非常重要的作用，有研究顯示串珠素還可促進神經纖維的修復。在骨折愈合時，成骨細胞會表達一定的串珠素，串珠素有利于骨折的愈合[1]。本次研究以期通過研究一定濃度的TNF-α、IL-6對體外培養胎鼠成骨細胞中串珠素mRNA表達的影響，找出一種抑制成骨細胞活動的機制，加以干預，促進骨折愈合的治療。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：10只新生SD大鼠（24 h）。實驗試劑：DMEM培養基、胎牛血清、RT-PCR試劑盒、0.25%胰蛋白酶等。實驗儀器：CO2培養箱、酶標儀、PCR儀等。

1.2 實驗方法 通過酶消化方法提取胎鼠顱蓋骨成骨細胞，并進行傳代培養。在6孔培養板中，以105/mL密度接種傳代培養的第3代成骨細胞，每孔100 mL細胞懸液，在37oC下培養24 h。將細胞分為3組（6孔/組）：A組加入等量細胞培養液；B組加入10 ng/mL TNF-α；C組加入100 ng/mL IL-6。在24 h、48 h、72 h時，收集每孔細胞，根據RT-PCR試劑盒說明書中步驟提取總RNA，使用特異性引物進行RNA的反轉錄，最后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過Quantity one軟件測定擴增條帶的灰度值，計算灰度比值。

1.3 統計學方法 通過SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析；計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在10 ng/mL TNF-α、100 ng/mL IL-6干擾下，24 h、48 h、72 h胎鼠成骨細胞串珠素表達量均顯著降低（P＜0.05），具有統計學意義，見表1。

表1 對比分析各組細胞串珠素mRNA灰度比（Mean±SD）

3 討論

機體中有TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子，作用靶目標為破骨細胞、成骨細胞，不僅會影響成骨細胞的活性，還會促使破骨細胞活性的增加[2]。所以，如果骨吸收刺激因子的表達過度，會使得喪失骨質多于形成的骨質，進而導致骨質疏松的發生，大幅度增加了骨折的發生率；此外，還會使得骨折愈合時間延長，嚴重的情況下可能會導致骨折不愈合的問題。大量研究顯示，TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子可促進破骨前體細胞的分化，激活NF-kB通路，反作用于TNF-α、IL-1/6，增加其表達量。

目前對骨吸收刺激因子的研究主要集中在破骨細胞的代謝、分化以及增殖等方面，有關對成骨細胞影響的研究比較少。TNF-α可抑制成骨細胞活性，但是其機制非常復雜，目前還未研究清除。在人體中，TNF-α受體是一種對抗成骨細胞強化因子的介質，TNF-α會抑制骨基質合成、成骨細胞分化，進而抑制骨形成。此外，細胞凋亡是TNF-α介導抑制的重要通路之一。相關研究表明，在一定濃度TNF-α作用下，成骨細胞會發生凋亡壞死。有研究人員通過大鼠實驗研究了骨折愈合過程中TNF-α的變化情況，結果顯示骨折部位牽引會影響骨痂的形成，部分骨組織中TNF-α表達量顯著上升，可影響骨折的愈合。有研究人員對吸煙對骨折愈合中TNF-α的表達進行了研究，結果顯示吸煙會使TNF-α表達量增加，進而使得骨折愈合時間延長。臨床上，有研究人員發現骨折、手術創傷會使得患者體內TNF-α、IL-6表達顯著增加，并且隨著創傷時間的延長，其表達量慢慢減小。在絕經后骨質疏松的發生中，IL-6因子起著非常重要的作用。上述研究均在一定程度上表明了骨折愈合中，TNF-α、IL-6起著非常重要的作用，然而大部分是以大鼠、小鼠等為實驗對象，在細胞水平上的研究比較少。

人體中，TNF-α、IL-6是非常重要的炎癥因子，過度表達會造成MODS，也是導致創傷、燒傷等患者死亡的重要因素[3]。臨床上，已經開始使用IL-1受體拮抗劑、腫瘤壞死因子單抗等炎癥介質類藥物治療SIRS過度反應造成的MODS上，但是其實際療效還需要深入研究。在骨折不愈合患者中，TNF-α、IL-6等的表達顯著升高，會影響骨折的愈合。目前，有關TNF-α、IL-6對骨折愈合的影響主要集中在破骨細胞方面，對成骨細胞（特別是分子水平）的研究相對較少。目前，已經有研究對串珠素、骨折不愈合間的關系進行了研究，結果顯示在骨折愈合中，串珠素起著非常重要的作用，會對骨折愈合產生一定的影響。在骨折愈合中，IL-6、IL-1、TNF-α之間是協同還是拮抗作用依然需要深入地研究，在臨床上可尋找一條新的道路，找出影響骨折愈合的一種因素，進而為骨折不愈合的治療提供新的治療方法。