兩種測定信陽茶葉中咖啡堿含量的方法比較

余艷芳，王曉，劉厚紅，郭建峰

兩種測定信陽茶葉中咖啡堿含量的方法比較

余艷芳，王曉，劉厚紅，郭建峰

（信陽市文新茶葉有限責任公司，河南信陽 464000）

茶咖啡堿測定GB/T 8312-2013給出了紫外分光光度法和高效液相色譜法兩種檢測方法，本研究采用以上兩種方法分別測定了不同經歷貯存期的信陽毛尖茶和信陽紅茶的咖啡堿含量。結果顯示，高效液相色譜法相對于紫外分光光度法測得的咖啡堿含量下降了近16%，且信陽毛尖茶和信陽紅茶下降比例相當。同時，由于生產工藝不同，信陽紅茶中咖啡堿含量總高于信陽毛尖茶。紫外分光光度法測得的咖啡堿含量偏高，因為包含了與其結構類似的其它嘌呤堿類物質。另外，若采用紫外分光光度法完全依照國標測得樣品的吸光度大于0.7，為保證結果的準確性，須將第一步反應試液用量減半。

紫外分光光度法；高效液相色譜法；咖啡堿；信陽毛尖茶；信陽紅茶

咖啡堿又名咖啡因，是茶葉主要功能成分之一，具有提神益思、緩解疲勞、強心、利尿的作用，它可溶于水，是形成茶湯滋味的重要物質。純咖啡堿是白色的，強烈苦味的粉狀物，茶葉中咖啡堿的特點是苦而不回甘。茶湯中咖啡堿能與兒茶素、茶黃素形成絡合物，從而提供了具有一定刺激性而又較為協調的爽口感。咖啡堿含量是目前許多國內、國際貿易對茶葉質量評價的一項重要指標，所以對茶葉中含有的咖啡堿進行準確測定是非常必要的。以往咖啡堿測定主要采用重鉻酸鉀滴定法、薄層色譜法、近紅外光譜法、分光光度法、液相色譜法、

1 材料

茶葉樣品

毛細管電泳茶樣均來自信陽市文新茶葉有限責任公司，信陽毛尖選擇2015至2018年的A100綠法、質譜法等[1]。國家標準GB/T 8312-2013采用的是紫外分光光度法或高效液相色譜法[2]。由于兩種方法依據的原理不完全一致，在測定咖啡堿含量時可能有所差異，因此本研究通過實測信陽毛尖和信陽紅中咖啡堿含量，進而比較兩種方法測定結果的一致性。茶，共4個樣品；信陽紅選擇2015至2018年的H100紅茶，共4個樣品。

茶樣一直貯存于溫度0~5℃的保鮮庫中，2015~2017年的茶樣為保鮮庫中的往年留樣。

儀器

高效液相色譜儀（LC-2010A HT島津），雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），分析天平（沈陽神宇龍騰天平有限公司），數顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠），循環水式真空泵（上海凌科實業發展有限公司），普力菲爾超純水機（上海富詩特儀器設備有限公司），微型植物試料粉碎機（北京市永光明醫療儀器廠）。

試劑

咖啡堿標準品（≥99%，上海源葉生物科技有限公司），甲醇（GR，天津市科密歐化學試劑有限公司），氧化鎂（重質AR，天津市科密歐化學試劑有限公司），堿式乙酸鉛（AR，上海山浦化工有限公司），濃鹽酸（AR，西隴科學股份有限公司），濃硫酸（AR，開封市芳晶化學試劑有限公司）。

2 方法

參照GB/T 8312-2013茶咖啡堿測定，第一法高效液相色譜法和第二法紫外分光光度法。

2.1 高效液相色譜法

咖啡堿標準液、分析原料的制備、測定、標準曲線制作和結果計算方法完全依據GB/T 8312-2013“3.1原理~3.5結果計算”進行。其中，高效液相色譜儀配備紫外檢測器，采用C18（ODS柱），檢測波長280nm；流動相為V甲醇:V水=3:7的混合液，過0.45μm膜，超聲波脫氣后使用；流速1.0ml/min，柱溫40℃，進樣量10μL。

2.2 紫外分光光度法

試劑和溶液配制、試液制備、咖啡堿標準曲線的制作完全依照GB/T 8312-2013執行。試液測定相比國標有所改動，操作如下：用移液管準確吸取5ml試液至100ml容量瓶中，加入4ml 0.01mol/l鹽酸和1ml堿式乙酸鉛溶液，用水定容至刻度，混勻，靜置澄清過濾。準確吸取濾液25ml，注入50ml容量瓶中，加入0.1ml 4.5mol/l硫酸溶液，加水稀釋至刻度，混勻，靜置澄清過濾。用10mm石英比色杯，在波長274nm處以試劑空白溶液作參比，測定吸光度（A）。

咖啡堿含量計算公式也根據試液實際用量相應調整。

3 結果與分析

3.1 GB/T 8312-2013標準曲線的建立

3.2 不同測定方法對信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量的影響

表1 HPLC和UV法測得供試茶樣中咖啡堿含量

注：A100為同等級的信陽毛尖、H100為同等級的信陽紅。

3.3 信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量比較

圖6 咖啡堿“信陽毛尖茶”試樣特征譜圖

圖7 咖啡堿“信陽紅茶”試樣特征譜圖

3.5 結果分析

采用GB/T 8312-2013中的兩種方法分別測定相同級別不同經歷貯存期的信陽毛尖和信陽紅茶中咖啡堿含量。由表1可知，對于不同年份的信陽毛尖樣品，HPLC法測得咖啡堿含量為3.90%~4.60%，而紫外分光光度法測得咖啡堿含量為4.83%~ 5.33%，HPLC法測得的平均含量下降了15.8%。對于不同年份的信陽紅茶樣品，HPLC法測得咖啡堿含量為4.92%~5.49%，而紫外分光光度法測得咖啡堿含量為6.01%~ 6.48%，HPLC法測得的平均含量下降了15.7%。由實驗結果可知，高效液相色譜法相對于紫外分光光度法測定的咖啡堿含量下降了近16%，綠茶和紅茶下降比例相當。

由圖3~4知，信陽紅中咖啡堿含量高于信陽毛尖。因為一方面紅茶是通過發酵加工制作而得，而綠茶沒有經過發酵，相關研究顯示茶葉發酵時間越長，咖啡堿含量就會越多，相同原料制成的紅茶咖啡堿含量普遍高于綠茶[3~6]；另一方面，咖啡堿在溫度達到178℃時開始變為氣體升華，文新信陽毛尖經殺青、生鍋、熟鍋炒制而成，相關研究顯示從鮮葉采摘到炒茶工序咖啡堿含量變化相對較大，不斷降低[7]，而紅茶不經過以上工序，這也是紅茶咖啡堿含量高于綠茶的原因之一。

對比2015~2018年相同級別的同種茶葉，咖啡堿含量與保存年限之間無明顯相關性。因為不同年份間氣候不同，供試茶樣的采摘日期也不完全相同，采摘期茶葉品質是一個動態變化過程[8]，因此供試茶樣本身咖啡堿含量不完全一致。茶咖啡堿含量與茶樹生長代謝有著密切關系，茶葉新梢哪里生長旺盛，哪里的咖啡堿含量越多[9]；茶樹哪個時期長得快，哪個季節的咖啡堿含量越多，夏茶比春茶含量高[10]。

4 小結與討論

兩種方法均為水溶液提取，它具有無毒、揮發性小、可操作性強的特點。

用HPLC法測定茶葉中咖啡堿含量，操作簡單，快速、準確。因為HPLC是通過流動相帶著樣品在固定相/流動相之間反復吸附-解吸附使樣品各組分完全分離，有選擇性強、專屬性好、靈敏度高的特點。分析一個樣品，最重要的就是樣品的專屬性，因此用HPLC測定的準確度要比一般沒有經過徹底分離的高。

紫外分光光度法樣品前處理是將茶湯經過絡合沉淀步驟，然后兩次過濾，其操作過程繁瑣，工作量較大。由實驗結果可知，紫外分光光度法的測定結果大于HPLC法。原因可能是分光光度法測得的咖啡堿包含了與咖啡堿結構類似的嘌呤堿及其它物質，所測結果不夠精準，這是分光光度法的局限性，這種局限性在周順珍的研究結果中也有說明[11]。

此外，GB/T 8312-2013紫外分光光度法中設計的咖啡堿標曲梯度最高濃度為0.012mg/ml，對應吸光度為0.568，如果樣品測定依照國標準確吸取10ml試液進行反應、過濾，之后測吸光度，預實驗結果顯示，大部分樣品的吸光度超過標準曲線的最高吸光度，并且部分信陽紅樣品的吸光度將大于0.8。考慮到紫外分光光度法檢測器的工作原理，為保證測量結果的準確性，應控制吸光度在0.2~0.7之間，透光率在20%~65%之間[12]。故本研究中樣品測定相比國標有所調整，第一步吸取試液量為國標的一半（5ml），從而使樣品吸光度全部在標準曲線范圍內。由此可見，采用紫外分光光度法測定茶葉中咖啡堿含量時，若樣品吸光度超過標曲的吸光范圍，甚至大于0.8，為保證實驗科學、嚴謹，應將試液稀釋后再使用，或者第一步反應試液用量減半。

[1] 譚和平，葉善蓉，鄒燕等.茶葉中生物堿的分析方法概述[J].中國測試技術，2008(5):5~9.

[2] 中華人民共和國國家標準GB/T8312-2013，茶咖啡堿測定[S].

[3] 馬燕，張冬蓮，李家華等.市售普洱熟茶與綠茶、紅茶咖啡堿質量分數的測定與比較[J].云南農業大學學報，2013,28（5）:745~749.

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[5] 陳韶華，張聲俊.紅茶與綠茶中咖啡因的提取數據探索[J].安順學院學報，2010,12（4）：91~93.

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[7] 黃歡，趙展恒，王玉嬌等.鐵觀音加工過程中咖啡堿、茶多酚、游離氨基酸含量變化研究[J].福建農業學報，2014,29（3）:282~285.

[8] 吳婧，徐平，金志鳳等.茶葉主要品質成分含量在采摘期的變化研究[J].中國茶葉加工，2015（2）：24~28.

[9] 王璽.茶樹葉片中主要特征物質的年變化規律研究[D]. 安徽農業大學. 2013

[10] 宛曉春主編. 茶葉生物化學[M]. 北京：中國農業出版社，2007:8~117.

[11] 周順珍，周國蘭，何萍等. 兩種方法測定茶葉中咖啡堿的應用比較[J]. 貴州茶葉，2011,40（1）：39~40.

[12] 謝慶娟，李維斌主編. 分析化學（第二版）[M]. 北京：人民衛生出版社. 2013.08, 180~192.

S571.1

A

1006-5768（2019）03-110-05

2019-01-16

信陽市科技成果轉化計劃項目：信陽毛尖茶精細化、智能化生產關鍵技術研究與應用（150002）。

余艷芳（1989—），女，河南信陽人，碩士研究生，從事茶葉生化分析與檢測研究。Email:576400501@qq.com

（責任編輯：蔣文倩）