乳酸菌去除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的研究進展

■吳宛芹 曲 睿 艾重陽 劉冠聞 師俊玲 蔣春美

(西北工業大學生命學院，陜西西安710072)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），又稱嘔吐毒素，是禾谷鐮刀菌產生的一類真菌毒素，易引起腸道病變，改變腸道屏障[1]，產生免疫毒性[2]，嚴重威脅著人類和動物的健康。DON 廣泛存在于食品和飼料中[3-5]，尤其是小麥、玉米和燕麥等受鐮刀菌侵染的籽粒中含量較高。DON 具有較強的抗加工和抗加熱能力[6]，難以徹底清除，對食品和農業造成嚴重的經濟損失。DON的環氧基團是其主要的毒性作用位點[7]（圖1），此外，C3 上的羥基在毒性方面也起著重要的作用，均可作為降解DON的作用位點。

圖1 DON結構圖

目前，關于去除DON 的方法主要有物理、化學和生物降解法，其中物理和化學降解方法主要包括紫外線照射[8]、氬等離子體[9]和臭氧處理[10]。臭氧處理雖對小麥和面粉的質量沒有負面影響[11]，但需要特殊的加工設備且費用昂貴，會對環境產生不利影響。生物脫毒特異性強、效率高，且是環境友好型，并可用于不同食品加工階段，具有其他方法不能比擬的優勢而被廣泛應用[12-13]。生物法主要通過微生物和酶解等方法去除DON。目前已報道許多細菌和酶能降解DON，但這些細菌或酶類能否直接應用于飼料及其他谷物等食品加工過程中還有待進一步研究。Doll 等[14]發現市售降解DON 的產品解毒效果不明顯，因此尋找有效的脫毒產品迫在眉睫。乳酸菌因其益生作用且不會影響產品的質量，已成為去除DON的研究熱點。

乳酸菌（Lactobacillus）是食品中常見的益生菌[15]，根據遺傳學上的差異，可以分為桿菌、梭菌、柔膜菌[16]。其中桿菌包括6個科，分別是球藻科、肉桿菌科、腸桿菌科、乳桿菌科、明串珠菌科和鏈球菌科[17]。乳酸菌能調節全身免疫應答[18-19]、抗炎[20]、預防宮頸癌[15]、緩解腦部疾病[21]、維持腸道微生物菌落平衡[20，22]、改善小鼠便秘[23]和減輕重金屬中毒癥狀[24]，提高機體抵抗力[25]。現已報道乳酸菌對不同真菌毒素均有去除作用，如去除黃曲霉毒素[26-29]、展青霉素[30]，并能顯著去除DON。

本文主要針對乳酸菌及其他細菌對DON的去除作用進行綜述，通過對其他細菌降解酶的分析，推測乳酸菌降解DON 的可能性及普遍性，展望了在飼料中添加乳酸菌去除DON的應用潛力。

1 去除DON的乳酸菌種類

目前已報道的能去除DON 的乳酸菌共有14 種（表1），主要為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbruekii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、黃乳桿菌（Lactobacillus jugurti）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），它們主要來源于食品和食品原料。其中，以植物乳桿菌、德氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的去除效率較高，為55%左右，其他乳酸菌的DON 去除率較低（13%～40%），這可能是因為不同菌株之間細胞壁成分的差異導致的。

2 乳酸菌去除DON的機制

2.1 生物吸附

微生物去除真菌毒素的方式主要包括生物吸附和酶解作用。目前已有報道的乳酸菌去除真菌毒素的機制多為生物吸附，作用機制為乳酸菌細胞壁上的肽聚糖和胞外多糖結合真菌毒素，形成可逆的復合物，從而去除真菌毒素。乳酸菌對DON 的去除方式包括吸附和降解作用，其中以生物吸附作用最為常見（表1）。El-Nezami 等[31]研究了鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）對DON的去除作用，發現活菌和滅活的菌株在去除DON 能力上沒有顯著差異，且未發現新物質生成，表明Lactobacillus rhamnosus GG通過吸附作用去除DON。Niderkorn 等[32]發現鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、布氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、黃乳桿菌、乳酸乳桿菌、干酪乳酸桿菌等多株乳酸菌均通過吸附作用去除DON，其中，植物乳桿菌和德氏乳桿菌去除能力最強，去除率高達55%。Franco等[35]利用高效液相色譜法分別對植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、類干酪乳桿菌的去除DON能力進行定量分析，發現這些菌株均能降低DON 的含量，但未觀察到新物質生成。Zou 等[36]研究了乳酸乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳酸桿菌、植物乳桿菌對DON的去除機制，結果表明，去除方式為物理結合而非生物轉化。Hassan等[37]發現熱滅活的清酒乳桿菌能夠顯著降低培養基中DON含量。

表1 乳酸菌對DON的去除作用及其DON降解酶

2.2 生物降解

目前已報道的能夠降解DON的微生物主要包括細菌和真菌。生物降解DON主要是通過破壞環氧基團或改變C3結構，降解產物多為低毒甚至無毒的脫氧化DON（DOM-1）、3-epi-DON、3-酮-DON。一般認為，細菌是通過降解酶將DON降解為低毒或者無毒的產物，稱為酶解過程。但也有關于DON的降解研究，只鑒定出降解產物，并未闡明產生生物降解作用的物質（酶或者其他物質），其生物降解的機制尚不明晰。

2.2.1 酶解

已報道的具有降解DON能力的酶類共有6種，以醛酮還原酶為主。Karlovsky[38]通過對DON 分子結構分析，預測C3位上的差向異構反應（從DON到3-epi-DON）具有常見性，該反應可能需要兩種酶參與，對比DON 及其產物結構確定該反應過程具有不可逆性。Hassan 等[39]證實了這種猜想，通過將合成的3-酮-DON 和DON 分別作為底物與德沃斯氏菌屬（Devosia mutans）反應，檢測反應產物，發現從DON 到3-酮-DON 和3-酮-DON 到3-epi-DON 由兩種不同的酶誘導，DON到3-epi-DON 在熱力學上更容易實現，解釋了該差向異構反應的不可逆性。3-epi-DON可能通過形成分子內氫鍵，破壞環氧基團，從而使其毒性降低。

由表2 可知，Carere 等從德沃斯氏菌屬（Devosia mutans 17-2-E-8）中分離出兩種能將DON轉化為3-epi-DON 的蛋白酶[40-41]，其中，將催化DON 到3-酮-DON的蛋白命名為DepA酶，催化3-酮-DON轉化為3-epi-DON 的蛋白命名為DepB 酶（圖2）。DepA 酶是PQQ依賴酶，在不存在PQQ情況下，該酶不能催化DON形成3-酮-DON。對DepB酶結構進行分析，發現該酶屬于醛酮還原酶（AKR家族），具有NADPH依賴性，熱穩定性中等，且易于凍干，有較寬的pH作用范圍。

He等[42]從麥田中分離出一株能將DON降解為3-epi-DON 的菌株Sphingomonas S3-4 菌株，并通過基因組序列分析比較，得到了能夠將DON降解為3-酮-DON 的酶AKR18A1，將重組的AKR18A1 蛋白在大腸桿菌中表達，發現該酶催化DON 的反應在一定的溫度和pH 范圍內是可逆的，在該酶存在下，加入NADP+，DON 可轉化為3-酮-DON，而在NADH 存在下，該酶將3-酮-DON轉化為DON。

表2 DON降解酶及其降解產物

圖2 酶降解DON示意圖

除了差向異構酶以外，國內外的研究學者還發現了支持其他反應的酶。Ito 等[43]發現了一種細胞色素P450系統能夠分解代謝DON。研究人員從湖水中分離出一種新菌株KSM1，通過基因組文庫篩選獲得P450基因ddnA，體外重組獲得一個電子傳遞鏈，將該酶系對DON 的作用原理進行表征，發現產物為16-HDON。通過小麥幼苗測定發現該氫化作用顯著降低了DON對小麥的毒性。

國內研究者也從其他真菌中找到能夠降解DON的酶，楊俊[44]利用和毒素含有相同的環氧基團的苯基環氧乙烷，通過環氧基團類似物對土壤中菌群進行篩選，篩選出一種能夠產生降解苯基環氧乙烷的菌株黑曲霉F1，從該菌株中提取出一種脂肪酶，并進一步證明該酶能夠降解DON 產生新的物質。王開萍[45]利用同樣的方法對土壤中菌群進行篩選，篩選出一株米曲霉As-w6，并對菌株所產生的降解酶進行純化鑒定，發現該酶屬于脂肪酶，且該酶在40 ℃以下和pH 值6～8 之間具有較好的穩定性，能夠降解DON 產生新的物質。

目前，尚無明確的研究表明乳酸菌中存在降解DON 的酶類。但Garcia 等[34]發現在鼠李糖乳桿菌RC007 無細胞上清液能降解DON，且不存在吸附作用。胡杉杉等[33]分離出一株副干酪乳桿菌，在37 ℃、pH值7時去除率最大，研究雖未分析是否存在降解產物，未比較滅活菌和活菌去除DON的差異，但根據最適反應條件推測此副干酪乳桿菌能降解DON。基于以上報道可以推測，乳酸菌中可能存在降解DON 的機制。

2.2.2 其他生物降解作用

除了上述已知可降解DON 的酶類，也有研究只鑒定了DON 降解后的降解產物，而其產生降解作用的酶類尚未闡明。

Binder等[46]、Binder等[47]和Fuchs[48-49]從瘤胃中分離出能夠脫環氧化DON的菌株，其降解產物為DOM-1。多個研究在雞腸道和土壤中[50-52]分離出的細菌能將DON 轉化為DOM-1[50，53-55]。研究人員通過富集培養從土壤中獲得一株能完全降解DON 的根瘤農桿菌（Agrobacterium rhizobium），其代謝產物為3-酮-DON，免疫抑制毒性顯著低于DON[56]。Ikunaga等[57]從土壤中分離出第一株能降解并同化DON 的菌株，屬于諾卡氏菌屬（Nocardioides sp.）。德沃斯氏菌屬（Devosia sp.）和Paradevosia shaoguanensis DDB001 通過作用于C3 位點降解DON[39，58-61]，降解產物為3-酮-DON 或3-epi-DON。Ito 等[43]發現新菌株Sphingomonas sp. Strain KSM1 可將DON 轉化為16-HDON。上述降解產物多通過高效液相色譜和氣相色譜進行鑒定，通過產物的保留時間確定產物的種類和結構（表3）。

表3 細菌對DON的降解作用及降解產物檢測條件分析

3 乳酸菌可能存在的降解機制

乳酸菌對DON 的去除機制，除了吸附作用可能存在降解作用，且這種降解作用可能是普遍現象。已經發現降解DON 的酶類，醛酮還原酶和P450 酶系普遍存在于各種細胞中。但是，目前尚未報道乳酸菌中存在降解DON 的酶類。本文利用Blast 對表2 中6 種降解酶進行生物信息學分析，發現部分乳酸菌中存在與AKR18A1 和DepB 相似的蛋白，分析這兩種酶所誘導的酶促反應，推測同時含有這兩種相似蛋白的菌株能將DON 轉化為3-epi-DON，首先AKR18A1 誘導DON 轉化為3-酮-DON，隨后DepB誘導3-酮-DON 轉化為3-epi-DON，完成兩步酶促反應。

利用NJ法對具有兩種相似蛋白的菌株構建進化樹（圖3），發現Lactobacillus sp. 2-3、Lactobacillus paralimentarius和Lactobacillus midensis這三種菌株最有可能存在降解DON為3-epi-DON 的能力。分析系統發育進化樹可知，多株乳酸菌具有降解DON 的能力，除圖3 中所示菌株，鼠李糖乳桿菌已證明能降解DON，說明乳酸菌中可能存在其他降解機制，且乳酸菌可能普遍存在降解DON 的能力。利用在線軟件PredictProtein 對AKR18A1 和DepB 進行分析，發現這兩種蛋白均存在于細胞質中，且可催化DON 到3-epi-DON 的差向異構反應；同時，只含有AKR18A1相似蛋白的乳酸菌也能將DON 轉化為毒性更低的3-酮-DON。

圖3 基于AKR18A1和DepB蛋白構建的系統發育樹

同時，對目前已經檢測出對DON 為生物吸附作用的乳酸菌（表1）進行分析，發現部分乳酸菌也含有與AKR18A1和DepB相似的蛋白，因此推測這些菌株對DON不僅存在吸附作用，還可能存在降解作用。

4 乳酸菌去除DON的應用

已有研究表明可在飼料中添加乳酸菌降低DON毒性，增強腸道抵抗力。Garcia 等[34]利用豬空腸外植體研究鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus RC007）對DON 的去除作用，發現鼠李糖乳桿菌可有效去除DON，緩解DON引起的腸道毒性，維持腸道健康，可作為飼料添加劑降低DON 引起的腸道毒性。Wu 等[67]和段永樂[68]通過研究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum JM113）對DON 引起的腸道毒性的保護作用，以肉雞為研究對象，發現該菌株能減少DON對腸道屏障的損傷，增加有益菌的豐度，增強腸道的消化吸收和代謝功能。在飼料中添加乳酸菌降低DON，可以改善機體調節能力，促進代謝消化和養分利用[69]。同時乳酸菌還能降低污染小麥中鐮刀菌毒素，提高小麥發芽率[70]。

5 展望

目前DON 的去除多采用DON 降解酶，或將菌株直接加入飼料或谷物中，但目前報道有效的菌株多來源于腸道或土壤中，這些菌株的安全性和有效性還有待評估。添加乳酸菌等益生菌去除DON將是未來發展的主要方向，能避免影響產品質量和對機體造成傷害，促進機體健康生長。

關于乳酸菌去除DON的機制已報道的多為吸附作用，但吸附作用往往可逆，復合物的穩定性受到很多因素的影響，菌種、處理方式以及環境因素都能導致復合物重新釋放毒素，不能永久去除，存在較大風險，使得利用乳酸菌降低飼料和食品中DON 受到限制。本文通過生物信息學分析，發現乳酸菌中可能普遍存在降解DON 的機制，且已有報道鼠李糖乳桿菌能降解DON。因此，未來進一步證明乳酸菌降解DON的機制，發掘乳酸菌中的新型DON降解酶，從而推動DON生物降解的研究及其在飼料及食品行業的應用。