添加飼用復合菌劑青貯全株玉米的效果研究

■楊夢婷 張夢瑤 徐養濱 郭萌萌 張 科 王小龍 楊雨鑫 陳玉林

(西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100)

青貯體系是現階段開展“節糧型”畜牧業的較優手段[1]，乳酸菌在厭氧條件下降低飼料的pH 值，利用可溶性碳水化合物產生CO2，抑制有害微生物的生長，使得青貯飼料進入穩定的貯藏狀態，從而達到青綠飼料長期保存的目的[2-4]。乳酸菌可以分為同型和異型發酵兩類，同型發酵可產生乳酸，異型發酵在產生乳酸的基礎上可產生乙酸、乙醇和CO2等產物[5]。酵母菌可以利用青貯料中的糖分進行生長繁殖，可增加飼料中的蛋白質含量，同時生成乙醇等物質，使青貯飼料具有酒香味。酵母菌只在青貯的發酵初期生長繁殖，隨著青貯料中氧氣耗盡，乳酸菌數量的增加和有機酸的積累則停止生長。但是酵母菌能分解飼料中的有機物質，降低青貯飼料的品質。因此，青貯飼料中微生物的種類和數量將決定青貯發酵的效果[6-7]。黑曲霉菌和芽孢桿菌在生長過程中可以產生的大量糖化酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶等酶類，通過降解植物體的多糖和木質素，破壞其連接的共價鍵。其次，青貯飼料滲出液增多，大量的有機物轉化為發酵底物，可供乳酸菌發酵，細胞壁裂解釋放的物質可以為青貯發酵提供更多的碳水化合物，作為菌體良好的生長底物，可以促進青貯原料中添加的復合微生物菌劑的大量增加，從而可以提高青貯飼料干物質的含量和提高青貯料中蛋白的含量，并且，飼料中糖類的增加在青貯早期可以加速乳酸菌的繁殖，使青貯飼料的pH值降低[8]。本試驗從實驗室篩選保存的優勢菌株中篩選組合，以乳熟期的全株玉米作為發酵原料，擬篩選出適宜青貯全株玉米的最佳菌株組合，從而有效的提高青貯全株玉米的感官品質和營養價值，以期為飼用復合菌劑的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用全株玉米刈割于西北農林科技大學動物科技學院畜牧站。青貯所使用的菌種來自實驗室分離儲藏菌種，其中乳酸菌4株、酵母菌3株、芽孢桿菌2株、黑曲霉菌1株。

試驗用培養基配方如下：LB 培養基采用10 g 蛋白胨、10 g酵母提取物、10 g氯化鈉溶于1 L蒸餾水配置而成。MRS 培養基為：10 g 蛋白胨、15 g 酵母提取物、20 g葡萄糖、5 g牛肉膏、5 g乙酸鈉、2 g檸檬酸三銨、2 g KH2PO4、0.25 g MnSO4、0.58 g MgSO4、l ml吐溫80溶于1 L蒸餾水，121 ℃高溫高壓滅菌；查氏培養基采用30 g 蔗糖、2 g 蛋白胨、1 g NaNO3、2 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、0.01 g FeSO4溶于1 L 蒸餾水配置而成。試驗用PDA 培養基配方為馬鈴薯去皮洗凈后稱取200 g切成條形或者塊狀，蒸餾水煮沸30 min以上，用紗布過濾、再加入20 g 葡萄糖溶于1 L 蒸餾水，121 ℃高溫高壓滅菌。

1.2 試驗設計

試驗設計分為對照組（C）和試驗組（G），其中試驗組分別按照原料的干物質重量添加不同比例的乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和黑曲霉菌液。為了控制水分含量，各組中添加相應體積的水使每組中加入水分的體積相同。對照組添加等量的水，均勻地噴灑在秸稈上，裝入發酵桶中，隨機區組設計，每組3 個重復，混合菌種添加比例為0.2%。具體見表1。

表1 試驗設計（%）

1.3 試驗方法

將玉米秸稈放入切割機內切成2～3 cm 左右長度，添加如表1所示不同比例的乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和黑曲霉培養液處理后，以10 kg 為單位裝入發酵桶中，壓實排除空氣密封，置于常溫下。于發酵后0、3、7、14、21、28、42 d 和60 d 取樣，取發酵到預定時間的青貯飼料，將青貯堆表面5.0 cm左右的一層青貯料去掉后，混勻后采用四分法進行取樣，裝入自封袋內。取樣后，現場進行感官評定，之后在實驗室內進行各種成分（干物質、pH 值、粗蛋白質、粗纖維、揮發性脂肪酸和活菌數）的分析。

1.3.1 現場評分

按照我國農業部下發的《青貯飼料質量評定標準》[9]，開封時對全株玉米青貯飼料的色澤、氣味和質地等感官指標評定，并進行評分。

1.3.2 青貯飼料營養成分測定

利用烘干法檢測玉米青貯樣本干物質含量：干物質含量（%）=（烘后總重-烘后袋重）×100/烘前樣重[10]，取50 g 鮮樣，置于65 ℃的烘箱中48 h，冷卻后稱重，粉碎后盛于塑料封口袋中用于粗蛋白質、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量的測定。取青貯飼料樣品20 g，加入180 ml 蒸餾水密封，4 ℃靜置24 h 后，根據青貯飼料理化品質評定標準[11]用pH 計測定pH 值。利用凱氏定氮法測定粗蛋白質的含量。利用范氏法測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量[12]。揮發性脂肪酸用氣相色譜法測定[13-14]。活菌菌落數的檢驗采用生物計數的標準平皿涂布法，將樣品稀釋至適當濃度，用特定的培養基，在37 ℃培養箱中培養，計數平板中長出的菌落數，對活菌進行計數[15]。

2 結果與分析

2.1 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米的品質評定

根據青貯飼料的質量評定標準，將對照組與試驗組進行現場評分，觀察得出試驗組青貯全株玉米呈酸香味適口性好，亮綠色與黃綠色、質地松軟不粘手等，其評分顯著高于對照組。具體品質評定指標見表2。

表2 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米品質評定

2.2 青貯全株玉米飼料營養成分測定

2.2.1 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米干物質變化（見圖1）

圖1 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米干物質變化

如圖1所示，在青貯全株玉米的過程中，干物質含量呈現出較強波動變化。其中3個試驗組的波動幅度較大，添加復合益生菌使得干物質有輕微的損失。在發酵的3～42 d，添加復合菌劑的發酵青貯全株玉米的干物質含量均小于對照組，且最終差異不顯著。

2.2.2 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米pH 值變化（見圖2）

如圖2所示，在青貯全株玉米發酵前3 d，pH值大幅度下降，第14 d 以后緩慢降低并基本保持穩定，變動范圍在3.6～4.5 之間。試驗組發酵過程中pH 值變化幅度基本一致，對照組在第42 d 以后pH 值出現升高趨勢，各試驗組之間pH 值變化差異不顯著。在發酵青貯的各個時間點，對照組的pH 值顯著高于試驗組，保持在4.0以上。

圖2 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米pH值變化

2.2.3 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米粗蛋白質的變化（見圖3）

圖3 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米粗蛋白質的變化

由圖3可得，對照組和試驗組粗蛋白質含量在0～14 d 呈現顯著上升趨勢，第14 d 以后含量降低，第28 d以后含量基本保持穩定。與對照組相比，不同添加比例的復合菌劑對于發酵青貯全株玉米粗蛋白質的含量影響不大，根據ANOVA 單因素分析發現對照組和試驗組之間差異不顯著，試驗組之間含量變化差異不顯著，但整體上試驗組粗蛋白質含量高于對照組。在青貯第60 d時，各組粗蛋白質含量均超過8%。

2.2.4 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米粗纖維的變化（見圖4、圖5）

圖4 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米中性洗滌纖維變化

圖5 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米酸性洗滌纖維變化

纖維含量的高低直接決定著動物對飼料的利用效率。其中中性洗滌纖維主要包括纖維素、半纖維素、硅酸鹽、木質素。酸性洗滌纖維主要包括纖維素和酸性纖維素。通過范氏法系統評價試驗中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的變化發現：青貯全株玉米中性洗滌纖維含量在0～14 d 出現顯著的下降趨勢，在14 d 后基本保持穩定。試驗組與對照組相比差異顯著，其中，G3 組在0～14 d 下降幅度最大。根據ANOVA 單因素分析發現對照組與試驗組之間在同一時間點的變化差異顯著。具體的變化趨勢如圖4所示。

如圖5所示，青貯全株玉米的酸性洗滌纖維含量在0～3 d 顯著降低，之后保持動態的變化過程。就60 d時試驗組與對照組相比，差異不顯著。說明添加復合益生菌不會導致發酵青貯全株玉米中ADF 的顯著降低，但會顯著降低NDF含量。

2.2.5 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米揮發性脂肪酸變化（見表3）

有機酸的含量決定青貯全株玉米的品質優劣，其中最重要的指標是乳酸、乙酸和丁酸。優質的青貯全株玉米含有高豐度的乳酸和乙酸，丁酸含量極低。通過氣相色譜儀測定不同試驗組有機酸含量，更直觀地評價復合益生菌劑的添加是否能夠顯著提高發酵全株玉米的青貯品質。試驗結果發現：隨時間變化，對照組和試驗組乳酸含量明顯升高；乙酸含量均明顯升高；丙酸含量無明顯升高趨勢。試驗組乳酸含量在第60 d明顯高于對照組，總酸量也明顯高于對照組，表明試驗組的揮發性脂肪酸含量增多。

2.2.6 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米過程中活菌數變化

2.2.6.1 酵母菌變化規律（見圖6）

青貯全株玉米中初始酵母菌數為1.3×105CFU/g，由圖6 可得前3 d 3 個試驗組酵母菌數急速增加，第3 d 以后對照組、G3 組持續增加，而G1、G2 組快速下降，G3組在第7 d以后快速下降，說明前7 d是酵母菌快速增殖期，第7 d 發酵玉米青貯過程中酵母菌數目達到最大。第7 d試驗組與對照組的酵母菌數差異顯著，試驗組的酵母菌數目顯著高于對照組，表明添加復合菌劑有助于青貯玉米中酵母菌含量的快速增加。第7 d G3組的酵母菌數目顯著高于G1、G2組，表明經不同比例復合菌劑處理后的青貯全株玉米中酵母菌含量變化不同。

2.2.6.2 乳酸菌變化規律（見圖7）

發酵青貯全株玉米中初始乳酸菌數為2.0×105CFU/g，由圖7 可得青貯初期乳酸菌含量迅速增加，到第14 d以后乳酸菌含量趨于平緩。試驗組乳酸菌含量顯著高于對照組，表明添加復合菌劑有助于發酵青貯全株玉米中乳酸菌含量的快速增加。多重比較顯示乳酸菌含量在前7 d 內試驗組之間差異顯著，表明經不同比例復合菌劑處理后的青貯全株玉米中乳酸菌含量變化顯著。

表3 飼用復合菌劑發酵青貯全株玉米揮發性脂肪酸變化

圖6 發酵全株玉米青貯過程中酵母菌數變化

3 討論

本試驗利用飼用復合菌劑進行青貯全株玉米的發酵試驗，通過檢測試驗過程中發酵青貯全株玉米的感官指標和營養指標——干物質、pH 值、粗蛋白質、粗纖維、揮發性脂肪酸、活菌數的動態變化來表明添加復合菌劑發酵青貯全株玉米可以顯著的提高飼料的品質。與對照相比，添加復合菌劑的發酵青貯全株玉米具有酸香味、較好的口感和良好的色澤和質地，同時提高粗蛋白質和揮發性脂肪酸含量、降低pH 值和NDF 與ADF 含量，該結果與前期相關研究結果一致[8，16-18]。與葉方[19]的研究結果相似的是，在發酵的3～42 d，添加復合菌劑的發酵青貯全株玉米的干物質含量均小于對照組，且最終差異不顯著，說明在青貯過程中微生物對原料中營養物質分解較多，干物質有較少比例的損耗。

圖7 發酵全株玉米青貯過程中乳酸菌數變化

pH 值是評價青貯飼料重要的指標，pH 值越低，酸度越大，說明飼料得到了較好的保存[20]。白元生[21]認為，優良青貯料的pH 值應該在3.8～4.2 之間，當pH值下降到4.0 以下時，乳酸菌等有益菌發揮主要作用，其他各種有害菌被抑制，并且在青貯過程中有大量有機酸產生，其中乳酸菌產生的乳酸和乙酸是青貯過程中pH 值下降的主要因素。本試驗中，在發酵的前3 d，青貯全株玉米pH 值大幅度下降，與汪文忠[22]闡述一致。第14 d 以后緩慢降低，變動范圍為3.6～4.5。青貯全株玉米發酵時的整體pH 值下降，乳酸菌在發酵的過程中產生乳酸，乳酸使其保持酸性環境，有利于減少有害菌的含量，在60 d 試驗組青貯全株玉米pH 值為3.77～3.89，比張淑枝等[23]用乳酸菌劑處理的青貯全株玉米pH 值稍高，閆峻等[24]報道第50 d 玉米全株青貯飼料pH 值為3.59，本試驗結果相對也偏高。本研究中對照組pH 值下降幅度顯著小于試驗組，不同試驗組變化不顯著，說明不同比例的復合菌劑對青貯全株玉米pH 值的變化影響基本一致。

青貯飼料中的蛋白質通常有很高的瘤胃降解率，粗蛋白質的含量也是衡量青貯飼料品質的一項重要指標。通過上述試驗發現，發酵過程中粗蛋白質的含量顯著增加，與張淑枝等[23]所報道的一樣，與對照組相比，試驗組粗蛋白質含量均無顯著差異。本試驗中，試驗組粗蛋白質含量相對于對照組均有增加，第14 d 達到最高峰，之后下降的原因可能是發酵青貯玉米飼料中的微生物開始利用自身粗蛋白質，第28 d 出現小幅度上升可能是由于一些微生物死亡裂解后釋放部分菌體蛋白，這與李川東等[25]所報道的一致。

NDF 含量影響飼料的品質，NDF 含量高，青貯玉米適口性差，是目前反映纖維質量好壞的最有效的指標[26]。ADF影響反芻動物對飼料的消化能力，含量越低，飼料的消化率越高。本試驗中，在發酵初期復合菌劑中產酶類的菌體產生大量酶類，降解全株玉米中的纖維素，降低了NDF和ADF的含量。在發酵后期，當乳酸菌成為主導發酵的菌體后，乳酸含量增加，pH值降低，原料溫度升高，微生物生長被抑制，酶活性降低，所以青貯料發酵14 d 后粗纖維含量變化幅度較小，這說明發酵過程中NDF 和ADF 與微生物的活動變化相一致。復合菌劑處理的試驗組青貯全株玉米NDF含量顯著低于對照組，其中對照組和試驗組均有下降，與田瑞霞等[27]的結果相反，與劉金偉等[16]的結果一致。ADF 含量試驗組與對照組相比，差異不顯著，李旭業等[28]的研究中ADF 也沒有明顯的下降。但在王麗學等[29]的研究中，不同微生物菌劑的組合中ADF含量差異顯著，而NDF 差異未達顯著水平，可能主要與菌種所分泌的纖維素降解酶的種類有關。傅彤[2]的研究中，乳酸菌和纖維素復合酶共同使用使全株玉米青貯（60 d）NDF 和ADF 含量分別減少了15.8%、15.0%，本試驗對NDF 的降低效果要優于其研究結果，但對ADF含量的降低效果較差。本試驗說明添加此種復合菌劑不會導致青貯全株玉米ADF 的顯著降低，但會顯著降低NDF含量。揮發性脂肪酸是青貯飼料中可溶性糖厭氧發酵的主要產物，其含量和組成比例是確定青貯飼料發酵特性和評價青貯品質的重要指標[30]。

青貯質量的優劣取決于乳酸菌的作用，并且乳酸是乳酸菌主要的代謝產物[31]，它反映了青貯質量的好壞。乳酸也是影響pH值的主要因素，與pH值變化基本一致[32]，可以降低pH 值抑制雜菌的生長。本試驗中乳酸含量整體呈上升的趨勢，試驗組乳酸含量始終高于對照組，14 d 以后差異顯著，同時也達到穩定水平。有研究發現，添加同型發酵乳酸菌可以促進乳酸發酵，顯著增加乳酸含量，加快pH 值的下降，本研究中試驗組的乳酸含量始終高于對照組，與其結果一致[33]。杲壽善[34]報道，添加乳酸菌制劑的青貯料比常規青貯料品質進一步提高，適口性好，這也正是由于乳酸含量的提高。本試驗中，與G1、G3組相比，G2組的最終乳酸菌含量較高，且與G1組相比差異顯著，與G3 組相比差異不顯著。乙酸的整體含量升高，且增長速度先快后慢，增速減慢的原因可能是在發酵后期，氧氣被耗盡，青貯料溫度升高，較高的乳酸含量抑制了乙酸的生成，但最終乙酸含量試驗組高于對照組，其中，G1、G2 組顯著高于對照組。丙酸由丙酸菌發酵乳酸生成，丙酸的抗真菌效果很強，在抑制青貯飼料的好氧性腐敗方面有良好的效果，本試驗中丙酸含量各試驗組最終含量低于對照組，可能是由于對照組丙酸初始含量高于試驗組。

其次，乳酸菌可以在厭氧環境中將碳水化合物轉化為乳酸，乳酸菌最適生長的酸度為6.0，最低為4.0[35]。本試驗中乳酸菌數在發酵初期迅速升高，減少了腐敗菌的生長繁殖，并且在青貯發酵過程中明顯高于對照組，一段時間之后緩慢下降，最后趨于平緩，可能是由于營養物質被微生物消耗，隨著pH值的降低，乳酸菌的生長被抑制，但試驗組乳酸菌總體含量升高，這與任付平[8]試驗中乳酸菌數變化結果相似，說明復合菌劑中的其他微生物可以與乳酸菌相互促進生長。酵母菌數在發酵初期均迅速增加，酵母菌數在一段時間之后又迅速下降，最后趨于平緩，試驗組酵母菌數始終顯著多于對照組。酵母菌數開始增加可能是由于全株玉米最初含水量較為豐富，溢出的汁液較多，加上剛密閉的環境中有氧氣殘留，故酵母菌數量迅速上升。而當氧氣逐漸消耗，乳酸菌和有機酸的積累，酵母菌數開始下降直至最終消失。

綜上所述，微生物復合菌劑在一定程度上提高了青貯全株玉米的感官品質并減少了營養損失，提高了飼料的可消化性。不同比例的復合菌劑雖然在整體上對青貯全株玉米的品質的影響一致，但效果仍有顯著差異。

4 結論

本次試驗采用動態評估的方式表明復合菌劑添加在發酵青貯全株玉米過程中扮演非常重要的作用，并能夠有效的降低發酵產物中pH 值與粗纖維的含量，提高粗蛋白質、揮發性脂肪酸的含量和活菌數。經過綜合比較分析，乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、黑曲霉菌的添加比例為3%、2%、2%、1%時發酵過程中各指標綜合變化較為理想。