生物酶法水解海魚皮的研究

■程 瑛 王 冠 呂夢嫻 劉 營

（武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢430074）

2017年漁業年鑒顯示：全國水產總量6 445.33萬噸，比上年增長1.03%；在國內漁業生產中，海水養殖魚類產量為141.94萬噸，比上年增加12.70萬噸，淡水養殖魚類2 540.98 萬噸，比上年增長0.88 萬噸[1]。隨著魚類產量的不斷增長，我國魚類加工產業不斷發展，2017年魚類的加工量達2 196.25萬噸。魚類加工業的快速發展，產生了大量的副產物，其中主要包括魚皮，占魚總重量10%左右[2]。魚皮中蛋白含量高，是巨大的潛在可利用蛋白資源，可用來制備膠原蛋白、明膠等產品，而膠原蛋白在醫藥、化妝品、保健品等高附加值產品領域已經得到廣泛的利用，因此，如直接廢棄魚皮會造成嚴重的資源浪費。

本實驗的目的是能夠合理的利用水產品下腳料，減少資源浪費，同時可以帶來一定的經濟效益，開闊水產品下腳料的市場。我國是馬哈魚加工和代加工大國，加工過程中產生大量廢棄魚皮。因此，本實驗以海魚皮馬哈魚皮為實驗材料。馬哈魚是名貴冷水魚，其魚皮膠原蛋白或明膠與其他魚類相比有自身特點，更易被吸收利用，被認為是開發膠原蛋白肽等功能產品的良好資源，具有廣闊的市場開發價值。國內外利用魚皮提取明膠的研究很多，所用魚皮原料多為鯊魚魚皮[3]、草魚魚皮[4]和單角革鲀魚魚皮[5]等，但是對馬哈魚魚皮提取明膠或者其他功能型膠原蛋白的研究較少。且國內未見馬哈魚魚皮加工利用的相關報道，國外對馬哈魚魚皮的加工利用研究也鮮有報道。

國內外很多的報道對魚皮的處理采用強酸堿的方法，此種處理方法不僅對環境污染大，并且操作復雜，耗時較長且危險，本實驗不采用傳統的酸堿處理方法，直接采用環保安全的酶解法來處理馬哈魚魚皮，得到目標分子量的小肽，并且減少環境污染。根據國際標準規定，平均分子量≤500 Da 稱為小肽，平均分子量1 000～3 000 Da稱為多肽，平均分子量3 000～5 000 Da稱為大肽。本實驗希望通過酶解法能夠得到目標分子量的肽，且比較幾種酶解法的可行性。

1 材料與方法

實驗用水應符合GB/T 6682 中二級用水的規格，使用試劑除特殊規定外，均為分析純。

1.1 試劑材料

1.1.1 酶制劑

堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶均來源于武漢新華揚生物股份有限公司。海魚皮為馬哈魚皮。

1.1.2 試劑和儀器

硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、濃鹽酸、無水碳酸鈉、溴甲酚綠-甲基紅指示劑、三氯乙酸（國藥集團），乙腈、三氟乙酸（色譜純），細胞色素C、抑酞酶、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（中國計量科學研究院）等試劑。

THZ-82 恒溫水浴搖床（常州國華），凱氏定氮儀（Foss），高效液相色譜儀（安捷倫）：配有紫外檢測器和含有GPC數據處理軟件的色譜工作站或積分儀，凝膠色譜柱（賽分科技）。

1.2 方法

1.2.1 海魚皮的酶解反應

按照馬哈魚皮與水的質量比1∶4的比例配制魚皮水混合液，其中水的pH值提前使用10%的碳酸鈉調節至8.0～9.0，記錄反應器和魚皮水混合液的總重，在50 ℃恒溫水浴搖床中預熱5～10 min，按照各添加量加酶制劑，攪拌均勻，繼續于50 ℃恒溫水浴搖床中酶解2 h，酶解完成之后，沸水浴滅酶10 min，冷卻，定重，檢測各項指標。

1.2.2 水解度

凱氏定氮法測定。

1.2.3 酸溶蛋白

TCA法測定。

1.2.4 肽分子量檢測

色譜柱：SRT SEC-150 7.8×300 mm（內徑）或性能與此相近的同類型其他適用于測定蛋白質和肽的凝膠柱。流動相：乙腈+水+三氟乙酸=19.98+79.92+0.1。檢測波長：220 nm。流速：0.5 ml/min。檢測時間：33 min。進樣體積：20 μl。柱溫：25 ℃。

相對分子量標準曲線制作：分別用流動相配制成質量濃度為1 mg/ml的上述不同相對分子質量肽標準品溶液，按一定比例混合后，用孔徑0.2～0.5 μm 有機相膜過濾后進樣，得到標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數對保留時間作圖或作線性回歸得到相對分子質量校正曲線及其方程。

1.2.5 不同的酶制劑

a 組：堿性蛋白酶：添加量分別為質量分數0.30%、0.40%、0.50%、0.60%；

b 組：中性蛋白酶：添加量分別為質量分數0.36%、0.48%、0.60%；

c 組：木瓜蛋白酶：添加量分別為質量分數0.23%、0.30%、0.46%；

d組：木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3：添加量分別為質量分數0.50%、0.60%、0.70%、0.80%。

以上四組實驗的添加量設計原則為保持四種配方的成本一致。按照上述四組實驗配制實驗用酶制劑，對馬哈魚皮進行酶解實驗，比較常見指標水解度、酸溶蛋白、肽分子量≤1 500 Da 的分布。實驗設計組如表1。

2 結果

2.1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后的各項指標見表2，從表2中可看出，添加量逐漸加大，其水解度和酸溶蛋白的變化小，無法比較出哪個添加量的酶解效果好，從肽分子量≤1 500 Da分布可看出，堿性蛋白酶的添加量為0.3%時最差，添加量逐漸增大，目標肽分布面積逐漸變大，但趨勢并不明顯，因此，可以根據對分子量的需求來確定堿性蛋白酶的添加量。

表1 實驗設計組

表2 不同添加量的堿性蛋白酶的酶解結果

圖1 中標準品，從10 min 開始出現四個明顯的峰，依次為細胞色素C（分子量為12 500 Da）、抑酞酶（分子量為6 500 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（簡稱四肽，分子量為451 Da）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（簡稱三肽，分子量為189 Da）；添加量為0.3%的堿性蛋白酶，在10 min 之前出現一個峰，根據標準品信息可斷定此峰的化合物分子量在12 500 Da 以上，說明此添加量下，存在未被酶解的化合物，因此需加大堿性蛋白酶的添加量。比較另外三個添加量，從色譜圖可看出，在15～25 min之間，三組添加量的肽分子分布基本重合，差異表現在峰面積有所不同，添加量越大，峰面積越大，但是遞增趨勢并不明顯。

圖1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

從表2 和圖1 可看出，隨著堿性蛋白酶添加量的改變，有明顯變化的是添加量從0.3%到0.4%，分子量≤500 Da的肽分布面積增大，從0.4%開始的添加量各指標顯示分子量1 500 Da 以上的肽的分布變化差異不明顯。四組添加量中水解度、酸溶蛋白這兩項指標并無明顯差異。

2.2 不同添加量的中性蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過不同添加量中性蛋白酶酶解之后的各指標見表3，從表3 可看出，添加量逐漸增大，其水解度和酸溶蛋白的變化差異小，而酶解之后肽分子量≤1 500 Da的分布比例增大。

圖2中標準品分析同圖1分析。從色譜圖中可看出，三種添加量的中性蛋白酶出現的峰基本重疊，差異在于峰高不同，依次為0.60%的中性蛋白酶＞0.48%的中性蛋白酶＞0.36%的中性蛋白酶，因此，從色譜圖來看，添加量越高，出現重疊部分的峰面積越大，說明添加量增大，各目標肽的含量在增加。

從表3 和圖2 可以看出，目標肽的分布面積在緩慢增大，但并不明顯，當中性蛋白酶的添加量到0.60%，分子量≤5 000 Da的肽的分布面積達到90%左右，說明中性蛋白酶添加量到一定的量時，完全可以都酶解為分子量為5 000 Da的肽。

表3 不同添加量的中性蛋白酶的酶解結果

圖2 不同添加量的中性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

2.3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解效果

馬哈魚皮通過不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后的各項指標見表4，從表4 中的各指標可以看出，隨著添加量的增大，酸溶蛋白幾乎無變化，水解度先增加后降低，而肽分子量基本上都在1 000 Da以下，說明木瓜蛋白酶的效果很好，如果目標肽分子量需求是1 000 Da 以下，可以選取合適添加量的木瓜蛋白酶。

表4 不同添加量的木瓜蛋白酶的酶解結果

表4中木瓜蛋白酶的添加量在增加，分子量300 Da以下的有差異，有下降的趨勢，而分子量1 000 Da 以下的差異不明顯。

圖3中標準品分析同圖1分析。從色譜圖上可看出，三種添加量的木瓜蛋白酶出現的峰基本重疊，最高峰值的保留時間離四肽較近，并且三組不同的添加量下，僅出現一組比較明顯的峰，可見，經過木瓜蛋白酶酶解之后的肽基本集中在一起，并且三種不同的添加量的木瓜蛋白酶的出峰的峰高也基本重合，說明木瓜蛋白酶的添加量可以更少。

從表4 和圖3 可以看出，木瓜蛋白酶的作用效果很明顯，酶解之后的肽分子量大多≤1 000 Da，根據下游產品的需求，如果希望魚皮酶解之后多為≤1 000 Da，可選擇采用木瓜蛋白酶進行酶解。

圖3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

2.4 不同添加量的復合酶制劑（木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3）酶解效果

馬哈魚皮通過不同添加量的復合酶制劑酶解之后的各項指標見表5，從表5中各指標可以看出，復合酶制劑添加量為0.8%時，水解度最高，酸溶蛋白最高，但是分子量≤1 000 Da的肽分布面積反而降低，而添加量為0.7%的分子量≤1 000 Da的肽分布比例最高；其次，復合酶制劑添加量增加，分子量≤300 Da的肽分布比例增加，當添加量到0.80%時，出現下降趨勢，說明復合酶的使用不能提高小肽含量，可以明顯提高多肽的含量。

表5 不同添加量的復合酶制劑的酶解結果

圖4中標準品分析同圖1分析。從圖4上可以看出，除了添加量為0.80%復合酶制劑的峰高比較高，其他三條基本重合，說明0.5%、0.6%、0.7%三個梯度，隨添加量增加，并不明顯增加≤3 000 Da肽的含量。

3 討論

3.1 不同添加量的堿性蛋白酶和中性蛋白酶對馬哈魚皮的酶解

堿性蛋白酶和中性蛋白酶均是一種內切酶，多屬于絲氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶催化底物蛋白質水解時通常有兩個步驟：在水解過程中，隨著氨基酸的丟失和肽鏈的斷裂還形成共價酶-肽復合的中間二聚體；然后脫去酰基，通過水對中間體的親核攻擊，從而使底物肽鍵水解。堿性蛋白酶的酶切位點主要斷裂疏水氨基酸的C 末端，可特異性切割谷氨酰胺-組氨酸、絲氨酸-組氨酸、亮氨酸-酪氨酸、酪氨酸-蘇氨酸之間的肽鍵[6]。而中性蛋白酶對酶切位點無特異性。兩種酶的作用效果來看，中性蛋白酶的水解度稍差。從分子量的分布情況來看，兩者的小肽含量分布面積較高，肽分子量≤5 000 Da 的分布情況在成本一致的情況下，隨著添加量的增大基本趨于一致。由于酶解馬哈魚皮之后需制作的產品的要求各不相同，因此，可以根據產品需求選擇相應的配方。

3.2 不同添加量的木瓜蛋白酶對馬哈魚皮的酶解

木瓜蛋白酶是一種內切酶，屬于巰基蛋白酶，可水解絕大多數肽鍵，但對不同肽鍵水解的速率相差較大，該酶對蛋白質或多肽中精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽鍵非常敏感[7-10]。它的作用機制為：在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生，然后Cys-25親核攻擊主鏈上的羧基端，并與之共價鏈接形成酰基-酶中間體，接著酶與一個水分子作用，發生去酰基化，并釋放肽鏈的羧基末端，他的酶切位點具有廣泛特異性，主要包括Arg-、Lys-、Phe-X-。木瓜蛋白酶屬于動物性水解蛋白酶，從酶解之后的水解度來看，添加量變大，水解度出現下降趨勢，但是小肽含量的分布情況變化不大，集中在300～1 000 Da，如果產品對小肽要求含量比較高，木瓜蛋白酶是個很好的選擇。

圖4 不同添加量的復合酶制劑酶解之后高效液相色譜圖

3.3 不同添加量的復合酶制劑對馬哈魚皮的酶解

復合酶制劑包括木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，這兩種酶均屬于內切酶，但是兩種酶均有各自專屬的肽鍵切割位點，其水解活力均較高，因此可將這兩種酶組合使用。組合使用之后水解度均達到80%以上，小肽含量隨著添加量的增加先增大后減小，分子量3 000 Da以下肽的變化差異小。可根據產品需求選擇合適的添加量配方。

4 結論

①本實驗選取的四組酶制劑配方，其水解度都達到80%以上，堿性蛋白酶效果更佳；酸溶蛋白的含量均在2.0%左右，差異不明顯。

②從整體的分子量分布來看，木瓜蛋白酶的效果最好，酶解之后基本都是小肽，其次是堿性蛋白酶，其次是中性蛋白酶，復合酶制劑效果最差。