幾種深色食物中原花青素含量及抗氧化活性的測定和比較

卜得新，張方艷，朱桂蘭，郭 娜，魯紅俠

（合肥師范學院生命科學學院，安徽合肥 236001）

原花青素，通常別稱為縮合單寧，是類似黃酮一樣的由黃烷-3-醇單體慢慢縮小合成得到的聚多酚類地物質，還具有生物活性[1]。它普遍存在于植物的葉子、皮、果食、根中[2]，尤其是深色的食物，所以研究原花青素與色澤的關系可以更好地在外觀上判別食品中原花青素的含量。維C、維E是比較常見的抗氧化活性物質，但實際上原花青素比這2個的抗氧化活能力要高得多，去除人體存在的自由基效果也很好，而且能夠防止因自由基導致的很多疾病，如心臟方面的疾病、關節炎等，所以它是一種很好的天然抗氧化劑[3]。因其抗氧化活性好，所以在保健品和化妝品領域中應用比較廣泛。研究原花青素的抗氧化活性和測定其在食物中的含量能夠更好地了解和利用原花青素來保健和預防一些疾病。

藍莓、紫薯和巨峰葡萄這3種深色食品中含有大量的原花青素，并且藍莓中原花青素的含量僅比公認第一的新鮮黑枸杞低一些。目前，在工業上對藍莓、紫薯和葡萄的利用較多，在生活中這3種深色的食物也因為營養價值高而深受廣大消費者的喜歡，而這三者的營養價值就是來源于其中的生物活性物質——原花青素。試驗利用3種深色物質來測定其原花青素的含量，并比較三者的抗氧化性。高效液相色譜儀不但具有快速分離、極強的靈敏性和高度的自動化等方面的優勢，還比一般的測定方法簡單快速[4]。主要利用高效液相色譜儀來測定藍莓、紫薯和葡萄這3種深色食物中原花青素的含量，并比較三者對超氧陰離子自由基的斷根效率[5]、DPPH自由基斷除效果[6]，以及OH自由基的斷除效率[7]的檢測，旨在為人們的生活和生產提供一定的依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓，采自合肥師范學院藍莓基地；紫薯、巨峰葡萄，購買于禹州華僑城誼品生鮮超市。

原花青素標準品（＞98%）、甲醇試劑（色譜純）、磷酸（色譜純）、甲醇、無水乙醇、鄰苯三酚、雙蒸水、Tris-HCl（pH值8.2）、DPPH試劑、過氧化氫、水楊酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-1260型安捷倫高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司產品；LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松原華興科技發展有限公司產品；722S型分光光度計、FA1104N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品；80-1型離心機，杰瑞爾電器有限公司產品；HH-S型恒溫水浴鍋，國勝實驗儀器廠產品；CR-400型色差儀，柯尼卡美達能中國投資有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料的預處理[8-15]

取新鮮的藍莓、紫薯和巨峰葡萄，將3種深色食物進行清洗，葡萄去籽，再將3種深色食物放入攪碎機中分別攪碎，將攪碎后的樣品放入低溫冷凍冰箱預冷20 h，最后利用真空冷凍干燥機對樣品干燥48 h后留著備用。

稱取2 g樣品放在50 mL的棕色容量瓶中，加入30 mL的甲醇，利用超聲提取20 min，冷卻至室溫，再用甲醇定容到50 mL，以轉速3 000 r/min離心10 min，重復2次，取上清液留著備用[4]。

1.3.2 原花青素標準曲線的制備

稱取10 mg（精確到0.01 mg） 原花青素的標準品，放在10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并且定容至10 mL刻度線，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準溶液。精確的吸取標準溶液0，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容到刻度線，搖晃均勻。然后各個質量濃度吸取1.0 mL進行反應，以樣品質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標制備標準曲線，做出回歸方程進行計算[4，16]。最后將3種樣品上機操作，調節合適的色譜條件，根據高效液相色譜儀出的色譜圖上對應的峰面積代入回歸方程，即可求出3種樣品中原花青素的含量。

1.3.3 原花青素含量的測定

精確調節色譜條件如下：耐低pH型C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）[17]，柱溫30℃，流動相為甲醇-0.3%磷酸（27∶73，V/V）[4]，流速1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長525 nm，將3種樣品進機操作，測出峰面積帶入標準曲線方程中計算出三者含量。

1.3.4 對超氧陰離子自由基的檢測

先將質量濃度為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3種樣品溶液放到有刻度的試管里，再加入5 mL Tris-HCl（pH值8.2） 緩沖液，用雙蒸水定容至9.7 mL，放于25℃條件下水浴保溫20 min，加到25℃預熱0.3 mL的濃度為3 mmol/L鄰苯三酚溶液中，于波長320 nm處每隔60 s測定吸光度1次，共測9 min[18]。計算3種待測溶液吸光度隨時間的變化率Fx。以1 mL蒸餾水代替上述過程中的3種待測溶液，計算出空白對照溶液吸光度隨時間的變化率F0。按下列公式計算超氧陰離子自由基清除能力[5]。

公式：F0——空白對照溶液的吸光度隨時間的變化率；

Fx——樣品溶液的吸光度隨時間的變化率。

1.3.5 DPPH自由基清除率的檢驗

分別吸取2.5 mL質量濃度為0.01，0.02，0.05，0.08，0.10 mg/mL樣品提取液與比色管中，加入2.5 mL濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液充分混勻，反應30 min，于波長517 nm處測定吸光度Ai，另外各取2.5 mL的上述質量濃度樣品提取液與比色管中，加入2.5 mL無水乙醇混勻，測其吸光度Ab，另取2.5 mL DPPH溶液與2.5 mL無水乙醇反應做參比，記錄其吸光度為Ac，同時測定維C對DPPH自由基清除率作為對比。

公式：Ai——樣品與DPPH混合液的吸光度；

Ab——樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光度；Ac——無水乙醇與DPPH混合液的吸光度。

1.3.6 OH自由基清除率的測定

分別吸取質量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3種樣品溶液中依次加入3 mL濃度為7.5 mmol/L FeSO4，3 mL質量分數1%H2O2搖勻后加入3 mL濃度為6 mmol/L水楊酸，搖勻并在37℃的水浴鍋中加熱15 min，于波長510 nm處測定其吸光度Ay，再利用體積分數50%的乙醇代替H2O2溶液，加入上述溶液并用相同的方法測定吸光度為Am，再利用體積分數50%的乙醇代替樣品溶液，測出吸光度為A0；最后用下列的公式計算OH自由基的清除率。

式中：A0——空白樣品對照吸光度；

Ay——加待測樣品吸光度；

Am——代替H2O2溶液測定的吸光度。

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線

原花青素標準曲線見圖1。

圖1 原花青素標準曲線

由圖1可知，標準曲線的線性關系式為Y=4 548.957 06X+8.410 72，R2=0.995 18相關性良好。

2.2 3種樣品中原花青素測定的結果

運用高效液相色譜儀，在適當的色譜條件下，檢測出紫薯樣品對應的高效液相色譜圖。

紫薯樣品高效液相色譜圖見圖2，巨峰葡萄樣品高效液相色譜圖見圖3，藍莓樣品高效液相色譜圖見圖4。

圖2 紫薯樣品高效液相色譜圖

圖3 巨峰葡萄樣品高效液相色譜圖

圖4 藍莓樣品高效液相色譜圖

由圖2可知，樣品所對應峰面積為Y=1 974.167 4，將其帶入關系式Y=4 548.957 06X+8.410 72中，可以得出X=0.432 mg/mL。所以，樣品紫薯中原花青素的質量濃度為0.432 mg/mL。利用同種方法根據圖3和圖4的數據可以測出巨峰葡萄和藍莓樣品中的原花青素分別為0.128，0.726 mg/mL。由數據可知，藍莓樣品提取液中的原花青素含量最高，其次是紫薯樣品中的原花青素，原花青素含量最低的是巨峰葡萄樣品。經查看相關資料[3]可知，藍莓原花青素存在于整個果實中，且含量很高，紫薯果皮中含有大量原花青素，但是果肉中淀粉含量很高，原花青素含量不高，所以整體沒有藍莓原花青素含量高，巨峰葡萄的原花青素主要存在于果皮中，果肉中大部分為多糖和水分，所以與藍莓和紫薯比較起來，巨峰葡萄中的原花青素含量最低。

2.3 對超氧陰離子自由基清除率測定的結果

3種深色樣品中原花青素對超氧陰離子斷根結果見圖5。

圖5 3種深色樣品中原花青素對超氧陰離子斷根結果

由圖5可知，在質量濃度為0.02 mg/mL時3種原花青素提取液對超氧陰離子的去除率最小，并且隨著質量濃度的增大，整個圖像呈現上升的趨勢，達到最大清除率的原花青素含量是0.1 mg/mL。相關研究表明，在堿性環境下，鄰苯三酚本身會產生氧化反應生成超氧陰離子，與原花青素產生相合，并且隨著原花青素質量濃度的升高，對產生的超氧陰離子的斷除效率也提升；原花青素的樣品對超氧陰離子自由基的斷除效率依次為藍莓＞紫薯＞巨峰葡萄。

2.4 DPPH自由基去除率的檢測結果

3種原花青素提取液對DPPH自由基清除率見圖6。

由圖6可知，3種深色食品中的原花青素對去除DPPH自由基的能力都好于維C，經過調查發現，原花青素去除自由基的能力比維C要強些。隨著樣品中原花青素的質量濃度變高，DPPH自由基的斷除結果也在不斷變大，說明質量濃度與DPPH自由基的去除率有一定的關系。但是，就3種樣品中的原花青素做對比可以看出，三者對DPPH自由基的去除效果都相差不明顯，結合誤差棒可以看出，數據的不明確性很大，可能因為在測量吸光度時，對時間和溫度沒有把控好。相關資料表示，原花青素的穩定性與溫度有關聯，所以產生較大的誤差，對試驗結果有所偏差[7]。

圖6 3種原花青素提取液對DPPH自由基清除率

2.5 OH自由基清除率的測定結果

3種不同質量濃度原花青素提取液對OH自由基清除率見圖7。

圖7 3種不同質量濃度原花青素提取液對OH自由基清除率

由圖7可知，隨著3種原花青素提取液質量濃度的增大，整個圖像呈現上升的趨勢，并且原花青素對OH自由基清除率的大小依次為藍莓＞紫薯＞巨峰葡萄。相關資料表明，原花青素濃度與OH自由基的去除效果存在明顯的關系，原花青素的濃度越大，對OH自由基的去除效果也就越明顯。

3 結論

隨著經濟增長和科技的發展，在解決了糧食短缺等問題后，人們越來關注保養和健康。原花青素的抗氧化性除了可以預防許多疾病，也可以起到美容和保健的作用。試驗利用生活中常見的3種深色食品為原材料提取原花青素，測定并比較其含量與抗氧化活性。結果表明，原花青素含量依次為藍莓＞紫薯＞巨峰葡萄；原花青素質量濃度與3種自由基都存在正相關的聯系，對超氧陰離子自由基和OH自由基清除能力依次為藍莓＞紫薯＞巨峰葡萄，去除DPPH自由基的能力相近，明顯比維C強。

試驗提取原花青素時，因為紫薯和巨峰葡萄中分別含有大量的淀粉和多糖，所以得到提取液中不止是原花青素，并且還含有其他物質，對抗氧化活性試驗有一定干擾，進而對抗氧化活性試驗的結果產生了一定偏差?？梢詢灮コ渲械牡矸酆投嗵牵瑢⑻崛∫褐性ㄇ嗨乇M可能地提取出來。