一株豬鏈球菌的分離鑒定及其生物學特性研究

鄒偉斌 梁秋燕 蔡東伶 陳漢鍶 李仕新 齊冬梅*

（1廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356；2仲愷農業工程學院，廣東廣州 510225）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）普遍存在于健康豬只體內，其中具有致病性的菌株可引起豬、人類和其他動物感染豬鏈球菌病[1]。該病是養豬生產中的常見病，給我國乃至全球生豬養殖業帶來巨大的經濟損失，影響食品安全及公共衛生，給人類的健康甚至生命安全帶來重大威脅，已被我國列為二類動物疾病[2]。本文通過從廣東省某養殖場分離鑒定豬鏈球菌，結合該菌株的生長特點、生化特征和抗生素敏感性，分析豬鏈球菌的病原學特性，為豬鏈球菌的培養、疫苗的制備篩選奠定基礎，為完善豬鏈球菌病的防控防治措施提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基、革蘭氏細菌染色試劑盒、豬鏈球菌生化鑒定盒、血瓊脂平板，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；r-Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準DL 2 000，購自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自英國OXOID公司；PCR引物，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉，購自上海市博微生物科技有限公司。

1.1.2 試驗菌株

所用菌株均從廣東省某養殖場牛奶樣品中分離得到。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離及形態鑒定

從樣品中分離出來的可疑菌株（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）分別接種在血瓊脂平板（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）上，37℃恒溫培養箱中培養24 h，根據菌落的生長形態，從平板上長出的菌落中挑選具有代表性的菌落，進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 分離菌株的PCR鑒定

將含有混合菌液的離心管（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）100℃水浴5 min，提取DNA作為PCR反應的模板；然后以16S rDNA通用引物進行擴增，引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GG TTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反應體系（50 μL）為：上、下游引物各2 μL，r-Taq DNA聚合酶25 μL，模板4 μL，滅菌去離子水17 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，然后進入35個循環，72℃延伸10 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，對應的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 分離菌株的生化鑒定

將分離出的豬鏈球菌新鮮菌苔置于無菌生理鹽水中，配制成菌懸液（約5×108CFU/mL），分別接種于12支微量生化管內，35～37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察各生化管的顏色變化[3]。

1.2.4 液體培養基的優化試驗

采用單因素法，以10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉作為基礎液體培養基（A），通過調整培養基配方中3種組分的含量，配制營養組分不同的試驗組和對照組。將基因測序確定為豬鏈球菌的菌株經過純培養得到的二級種子液分別轉接到不同營養組分的液體培養基中，置于37℃恒溫搖床中振蕩培養18 h，用無菌水稀釋至10-6、10-7、10-83個濃度梯度，進行平板活菌計數測定，并對計數結果進行統計分析。

1.2.5 生長曲線測定

將基因測序確定為豬鏈球菌的菌株經純培養得到的二級種子液轉接到擴大培養基中，置于37℃恒溫搖床中振蕩培養24 h，從第8個小時起每隔2 h取樣，進行平板活菌計數測定，記錄數據并繪制生長曲線。

1.2.6 藥敏試驗

采用紙片法進行藥敏試驗。取分離得到的豬鏈球菌純培養物接種到TSA培養基平板上，接種量為每平板菌液100 μL，均勻涂布，用無菌鑷子以“十”字貼法將30種抗生素藥敏片平貼于平板表面，倒置放入37℃培養箱中培養24 h，觀察并測定抑菌圈的大小[4]。

2 試驗結果

2.1 細菌的分離及形態鑒定

3個血瓊脂平板的菌落均呈灰白色，表面光滑，邊緣整齊，周圍無明顯溶血環，應為非溶血性或γ-溶血性鏈球菌；3個菌株的革蘭氏染色均呈紫色，說明均為革蘭氏陽性菌；血瓊脂平板Ⅰ的菌落直徑在0.1～1.0 mm，鏡下可見以長鏈存在的小球菌，血瓊脂平板Ⅱ和Ⅲ的菌落直徑在1～2 mm，鏡下可見菌體成對或中長鏈存在。

2.2 鏈球菌的PCR鑒定

3個菌株的粗提取DNA用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，產物進行核酸瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1，均成功擴增出目的條帶，約1 500 bp。將對應菌株的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與NCBI數據庫進行比對，確定菌株Ⅰ為無乳鏈球菌，菌株Ⅱ為乳房鏈球菌，菌株Ⅲ為豬鏈球菌。

圖13 株可疑菌的16S rDNA的PCR擴增結果

2.3 豬鏈球菌的生化鑒定

豬鏈球菌與12支生化鑒定管的反應結果見表1，與山梨醇、七葉苷、甘露醇、乳糖、甘露糖反應為陽性，與pH值9.6的肉湯、D-核糖反應為弱陽性，與菊糖、松三糖、阿拉伯糖、甘油、棉子糖均不反應。

2.4 液體培養基篩選

LB液體培養基單因素篩選設計見表2，不同液體培養基的活菌計數結果見圖2。氯化鈉的主要作用是提供無機鹽、調節滲透壓，由圖2可知，在蛋白胨和酵母提取物含量相同的情況下，氯化鈉含量低于10 g/L時，氯化鈉含量減少，活菌數減少，而氯化鈉含量高于10 g/L，可抑制菌株的生長；僅改變酵母提取物含量對豬鏈球菌的生長沒有明顯影響；蛋白胨對該菌生長具有明顯的促進作用，但達到一定含量以后，活菌數量趨于穩定。要有效提高豬鏈球菌的活菌數量，應綜合考慮培養基中營養組分的配比，使營養成分充分有效利用，實現產能最大化。

表1 生化鑒定結果

表2 LB液體培養基單因素篩選設計

圖2 不同營養組分的液體培養基培養菌落活菌計數結果

2.5 豬鏈球菌生長曲線測定

從圖3可知，豬鏈球菌活菌數在16～18 h達到頂峰，為2.15×108CFU/mL，18 h后活菌數呈快速下降趨勢，至20 h時活菌數趨于穩定，20～24 h活菌數穩定在1.60×108CFU/mL左右，34 h時活菌數又升高至1.80×108CFU/mL。在實際生產應用中，可以結合生長曲線，在合適的時間挑選菌種、菌齡，控制細菌培養時間，選擇最佳的補料時間，從而減少時間成本投入。

圖3 豬鏈球菌生長曲線測定結果

2.6 藥敏試驗

豬鏈球菌對30種常規藥物的藥敏試驗測定結果表明（見表3），試驗分離的豬鏈球菌對青霉素、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢曲松等β-內酰胺類抗菌藥物具有極高的敏感度；而對慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、四環素、多粘菌素B、克林霉素等則表現出一定的耐藥性。在臨床治療過程中，應科學合理地使用β-內酰胺類抗生素，建議交叉用藥或聯合用藥，從而降低抗生素耐藥的發生概率。

表3 豬鏈球菌抗菌藥敏紙片試驗結果

3 討論與結論

本文分離得到的豬鏈球菌的生化鑒定結果與甘露醇反應呈陽性，臨床上在甘露醇發酵試驗中，17、19、21這3種血清型中能分離出70%的陽性菌株[5]，可通過多種方法綜合分析，進一步鑒定此菌株是否為17、19、21血清型中的一種。本文豬鏈球菌在培養34 h時活菌數升高，可能是因為培養過程中隨著部分細菌死亡，細菌間養分競爭減少，為細菌的繁殖提供了條件。蛋白胨作為豬鏈球菌生長所需的重要成分，活菌數隨蛋白胨含量的增加而增加，但達到一定含量后，活菌數變化不明顯，可能是由于氯化鈉和酵母提取物的含量固定，各營養組分的配比不平衡，沒有達到利用率最大化。藥敏試驗結果顯示，該株豬鏈球菌對青霉素、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢曲松等β-內酰胺類抗菌藥物具有極高的敏感度，在臨床上用于治療和防控豬鏈球菌病具有重大意義，但應科學合理使用此類抗生素，建議交叉用藥或聯合用藥，從而降低抗生素耐藥的發生概率。豬鏈球菌的分型繁多，生化特性、生長特點多樣，對其生長特性變化、各分型對藥物的敏感性仍需要開展進一步的研究。