豬源綠色氣球菌的分離與鑒定

劉 潔 劉夢龍 曲久燕 張成東* 郭海巖

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070；2河南牧翔動物藥業(yè)有限公司豬藥市場部，河南鄭州 450008）

綠色氣球菌（Aerococcus viridans）屬于鏈球菌科（Streptococcaceae）氣球菌屬（Aerococcus），是氣球菌屬的代表。該菌屬是1953年由Williams等[1]提議設(shè)立的一個菌屬。綠色氣球菌是革蘭氏陽性球菌，該菌廣泛分布于自然界，如空氣、塵埃、植物、動物和人體[2]。它為條件致病菌，在正常條件下一般不表現(xiàn)致病性，而當(dāng)機(jī)體免疫力下降或免疫功能不健全時，可以引起人類心內(nèi)膜炎、敗血癥、菌血癥以及關(guān)節(jié)炎等[3，4]，因此在人醫(yī)臨床上受到廣泛的關(guān)注。但在獸醫(yī)臨床上，關(guān)于氣球菌的研究相對較少[5]，本試驗(yàn)的開展有助于防治由氣球菌引起的感染，為獸醫(yī)臨床提供科學(xué)指導(dǎo)和參考依據(jù)。

2019年1月份，河南省某豬場保育仔豬大面積發(fā)病，臨床表現(xiàn)為病豬精神沉郁、共濟(jì)失調(diào)、關(guān)節(jié)腫脹、采食量下降；剖檢主要病變?yōu)榉尾砍鲅源笕~性肺炎、纖維素性腹膜炎、關(guān)節(jié)腔滑液渾濁。通過對發(fā)病仔豬的內(nèi)臟器官以及關(guān)節(jié)積液進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，16S rRNA基因擴(kuò)增和致病性試驗(yàn)，分離出了8株氣球菌，確定該豬場有綠色氣球菌感染。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料

病料采自河南某豬場保育發(fā)病仔豬的肺臟、脾臟、腎臟、下頜淋巴結(jié)以及關(guān)節(jié)積液。

1.2 試驗(yàn)動物

清潔級雌性昆明小鼠，體重為30 g，購自鄭州市中原區(qū)玉飛種兔經(jīng)營部。

1.3 主要試劑與培養(yǎng)基

THB肉湯培養(yǎng)基、THA瓊脂培養(yǎng)基以及綿羊鮮血、胎牛血清購自青島海博生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Premix taq DNA聚合酶購自寶生物生物工程有限公司；DL 2 000 DNA Marker購自百泰克生物有限公司；瓊脂糖膠購自上海英俊生物技術(shù)有限公司。

表1 PCR引物

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的分離及純化

無菌操作臺內(nèi)操作，用滅菌消毒后的剪刀將病料組織表面剪一切口，將切口面蘸于THA瓊脂平板（含綿羊鮮血），用無菌接種環(huán)將平板上的黏液均勻涂布于平板表面。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。挑取疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

2.2 16S rRNA基因序列的測定

挑取純化后的單克隆于3 mL THB（含5%胎牛血清）肉湯中，37℃恒溫?fù)u床220 r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。取對數(shù)期的新鮮菌液2 mL，1 2000 r/min離心3 min，棄掉上清，按照天根基因組提取試劑盒說明書操作，獲得模板，進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。引物是根據(jù)16S rRNA通用引物基因序列設(shè)計，由北京六合華大基因科技有限公司合成。引物見表1。

反應(yīng)體系見表2，16S rRNA PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸90 s，反應(yīng)30個循環(huán)；72℃延伸7 min。以無菌水作為陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液中130 V電壓恒壓電泳25 min，然后凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察結(jié)果后，PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

表2 PCR反應(yīng)體系

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將16S rRNA測定的序列結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站中BLAST界面進(jìn)行序列相似性比對。再應(yīng)用MegAlign程序與GenBank中的9株綠色氣球菌參考菌株的基因序列進(jìn)行比對和同源性分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2.4 致病性試驗(yàn)

將分離純化的綠色氣球菌用THB肉湯（含5%胎牛血清）增菌過夜培養(yǎng)。將試驗(yàn)動物分為4組，每組5只小鼠，從腎臟、脾臟和關(guān)節(jié)積液中分離到的綠色氣球菌各挑取1株（A1、A2、A5）分別腹腔注射小鼠作為試驗(yàn)組，剩余1組腹腔注射等量無菌THB肉湯作為空白對照組，每只小鼠注射量為400 μL。在適宜條件下隔離飼養(yǎng)，每隔6 h觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離純化

分離純化后得到的綠色氣球菌在血平板上生長良好，呈灰白色，表面光滑，邊緣整齊，菌落較小，形態(tài)單一，周圍有草綠色的α-溶血環(huán)，易與α-鏈球菌混淆。在THB（含5%胎牛血清）肉湯中生長良好，呈均勻混濁。

3.2 16S rRNA基因序列的測定

分離得到的8株氣球菌分別命名為A1～A8，其中從腎臟組織分離到的氣球菌命名為A1，脾臟分離到的氣球菌命名為A2～A4，關(guān)節(jié)積液中分離到的氣球菌命名為A5～A8。16S rRNA PCR擴(kuò)增得到1條1 500bp左右的條帶，見圖1。

圖116 S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

16S rRNA測定的序列結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站中BLAST界面進(jìn)行比對，結(jié)果均為綠色氣球菌。將分離得到的8株氣球菌與GenBank中的9株綠色氣球菌參考菌株的基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，分離菌與9株綠色氣球菌參考菌株（菌株來源見表3）的同源性在99.1%～100%之間，見圖2。基于16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化樹見圖3。

圖2 16S rRNA基因序列同源性分析

3.4 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠攻毒1 h后，精神明顯變得沉郁，反應(yīng)遲鈍，對照組小鼠均正常。但是此后并未表現(xiàn)出致病性，試驗(yàn)組與對照組小鼠均正常存活。說明綠色氣球菌在機(jī)體條件正常情況下為非致病性菌。

圖3 基于16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化樹分析

4 討論

氣球菌屬（Aerococcus）細(xì)菌是兼性厭氧革蘭氏陽性菌，在血平板上產(chǎn)生α-溶血環(huán)，與α-鏈球菌極為相似。鏡檢成雙或四聯(lián)排列。目前該菌屬有5個種，分別為：綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、尿道氣球菌（A.urinae）、柯氏氣球菌（A.christensenii）、血?dú)馇蚓ˋ.sanguicola） 和人尿氣球菌 （A.urnaehominis）[7]。綠色氣球菌是氣球菌屬的模式種。它是條件性致病菌，是一種人獸共患的細(xì)菌，廣泛存在于自然界。關(guān)于氣球菌的報道主要在人類醫(yī)學(xué)臨床上，在獸醫(yī)臨床上的報道相對較少。2007年，Martín等[8]對58株豬源綠色氣球菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌可能是豬的致病菌。2006年，謝彬等[9]從發(fā)病仔豬關(guān)節(jié)積液中分離到綠色氣球菌。2017年，董文龍等[10]從病死豬肺臟中分離到綠色氣球菌，致病性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌對仔豬具有致病性。

本次研究以河南省某豬場保育仔豬大面積發(fā)病為基礎(chǔ)，根據(jù)發(fā)病仔豬臨床癥狀，采取發(fā)病豬的肺臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)以及關(guān)節(jié)積液進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，16S rRNA基因的擴(kuò)增、基因的同源性分析以及致病性試驗(yàn)，成功從腎臟、脾臟以及關(guān)節(jié)積液中分離到8株綠色氣球菌，但是該菌并未引起正常健康小鼠的發(fā)病或死亡，說明該菌為條件致病性細(xì)菌，未發(fā)病的原因可能與機(jī)體的免疫狀態(tài)和環(huán)境條件有關(guān)。目前，綠色氣球菌感染豬的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，需進(jìn)一步研究。豬場應(yīng)做好防護(hù)工作，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，控制環(huán)境衛(wèi)生，切斷綠色氣球菌的感染途徑。

表3 9株綠色氣球菌參考菌株的名稱與來源