降解臍橙囊衣專用霉的誘變育種及產酶工藝優化研究

龔靈茜

（湖南省長沙市雅禮中學，湖南 長沙 410004）

1 研究背景

筆者從湖南邵陽當地的臍橙主產區的腐爛臍橙、土壤中尋找產果膠酶的菌源。通過紫外誘變技術提高酶的產量，優化誘變菌株產酶培養基及其發酵條件，初步確定酶制劑脫囊衣工藝條件，為果膠酶大規模發酵提供參考依據，并且為生物酶法脫囊衣加工臍橙打下基礎。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 初篩各菌株的菌落形態特征。經連續馴化富集實驗后，以富含果膠質的臍橙囊衣果渣及柑橘果渣為唯一碳源及能源的培養基平板，對稀釋菌懸液進行培養，初篩結果及菌落形態特征描述見表1。

表1 初篩后各菌株的菌落形態

2.1.2 菌株復篩。將透明圈較大的P5、P6、P7、P8菌株，采用復篩培養基進行復篩，進行透明圈H(cm)、生長圈C(cm)值的測定和搖瓶產酶酶活力的定量檢測，測定結果見表2。

表2 復篩菌株H/C值與酶活力的比較

由表2復篩測定結果表明，菌株編號為P8酶活力較好；選擇該菌株進行分類鑒定。

2.1.3 菌株P8的分類鑒定。菌體形態特征。P8在PDA菌落初為白色，后其上密生一層黑色粉粒，似粗地毯狀。菌絲枝繁茂，幼時無隔，老齡有隔；小孢子囊常生在輪生孢囊梗的頂端，孢囊孢子大、色淡、單細胞。

分子生物學鑒定。真菌核糖體基因轉錄間隔區，又叫內轉錄間隔區，主要包括內轉錄間隔區1（ITS1）、5.8S rDNA、內轉錄間隔區2（ITS2），其兩側分別是18S RNA基因和28S RNA基因。rDNA在種內由于基因的流動而經常表現出很高的同源性，在種間則保持著各種程度的變異。變異的多少能夠反映生物進化上屬內種間親緣關系的遠近。將菌株P8的rRNAITS2基因序列與GenBank內登錄的不同種屬霉菌的相應序列進行比對，分析各株序列間的同源性和差異及進化關系。通過上述菌落培養特性、菌體形態觀察及18S RNA序列分析，初步鑒定P8為卷枝毛霉。

2.2 菌株P8的誘變及誘變株的篩選

2.2.1 紫外誘變時間。P8孢子紫外誘變劑量效應曲線如圖1所示?？梢钥闯?，P8孢子經紫外線照射后，再生菌落數逐漸減少。在0～10 min照射時間內，曲線的變化很明顯。20 min以后，曲線的下降趨于平緩。根據圖1計算出P8最佳誘變的照射劑量為8 min。

圖1 紫外誘變劑量效應曲線

2.2.2 誘變菌株的初篩

以8 min作為照射劑量誘變P8孢子，分別誘變3批，每批誘變后的單孢子懸液梯度稀釋后涂10個平皿。待孢子在平皿上已再生出菌落后，用滅菌牙簽將菌落挑入初篩平板中，每個平板10株誘變菌株，培養2～3 d。為此，從300多株誘變菌株中總共選出40株生長速度快的誘變菌株。

2.2.3 誘變菌株的復篩

分別將40株誘變菌株每株接2個果膠酶篩選斜面培養，計算液體發酵產酶活力。根據酶活力的計算結果，從40株誘變菌株中選出酶活力較高的5株，進行下一步的研究。根據誘變時的原始批次和編號，這5株菌分別命名為Y-9、Y-14、Y-19、Y-26、Y-37。

2.2.4 高產誘變菌株

取上述5株誘變菌株連同原始菌株在接種量相同條件下，進行液體搖瓶發酵產酶培養實驗，平行實驗3次，產酶結果取平均值，結果見表3。根據表3的結果，選產酶活力明顯優于原始菌株的Y-9、Y-26、Y-37編號的3株誘變菌株為高產誘變菌株。

表3 3株誘變菌株及原始菌株液態發酵產酶活力比較

表4 Y-9、Y-26和Y-37以及原始菌株P8連續進行10代發酵產酶培養實驗

2.2.5 誘變菌株產酶的遺傳穩定

鑒于誘變菌株的性狀常不穩定，對得到的3株誘變菌株（Y-9、Y-26和Y-37）進行產酶的遺傳穩定性實驗，結果見表4。

由表4可看出，Y-9和Y-37分別在傳代到第4代、第5代后，產量開始減少，遺傳不穩定。Y-26在連續轉接的10代里菌株的產酶活力都很穩定，并且都顯著超過了對照的原始菌株，其差異均達極顯著水平(p＜0.01)，顯示Y-26的遺傳性能穩定，可用于后續實驗研究。

2.3 誘變菌株Y-26的液體發酵產酶條件

2.3.1 不同碳源與誘變株Y-26的產酶活力。以常見的果膠含量較為豐富的果膠廢水、臍橙囊衣果渣、橙皮粉、柚皮粉、桔皮粉為材料。

添加純果膠及含果膠豐富的果膠廢水明顯促進誘變株Y-26聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的合成，表明這兩種酶都屬于誘導酶。雖然純果膠作為碳源產酶活力高，但純果膠價格昂貴，造成生產成本高；橙皮粉、桔皮粉、臍橙囊衣果渣作為碳源產酶更經濟，取材范圍廣，故用臍橙加工廢料作為Y-26的碳源來產酶，一方面可以節約成本，另外可避免因加工過程中囊衣及果皮丟棄造成環境污染。

2.3.2 不同氮源與誘變株Y-26產酶活力。本文以硫酸銨等為氮源探討了誘變株Y-26的產酶活力，結果見表5。

表5 不同氮源對誘變株Y-26產酶活力的影響

由表5可知，無機氮源硫酸銨產酶活力最高，平均達到35 172 U；尿素為氮源時酶活力次之；麥麩為氮源，菌株Y-26產酶力最低。因此，Y-26菌株以硫酸銨為氮源進行研究。

2.3.3 不同金屬離子與誘變株Y-26產酶活力。金屬離子能促進或抑制許多酶的產生，本文以Fe2+、Mg2+、Ca2+的不同濃度探討了誘變株Y-26的產酶活力。結果見表6。

表6結果表明，Mg2+對產酶影響最大，對產酶有一定的促進作用； Ca2+對產酶有一定的抑制作用； Fe2+對產酶基本無影響。

2.3.4 初始pH與誘變株Y-26產酶活力。在上述優化的基礎上進行了不同起始pH對誘變株產酶活力的影響，結果見表7。

由表7可知，誘變株Y-26對pH的適應范圍較廣，培養基起始pH在3～8均可發酵產酶，當pH為5，誘變株Y-26產酶活力最高。

表6 不同金屬離子對誘變株Y-26產酶活力的影響

表7 初始pH對誘變株Y-26產酶活力的影響

2.3.5 培養時間與誘變株Y-26產酶活力。應用前面優化出的最佳培養條件，考察培養時間對誘變株Y-26產酶活力的影響。結果見表8。

表8 培養時間對誘變株Y-26產酶活力的影響

由表8知，在時間為96～120 h范圍內酶活力較高，酶活力沒有顯著差異。考慮到產酶活力的穩定性、節省時間及發酵所需的能源，最佳發酵產酶時間有待進一步通過正交試驗優化。

2.3.6 不同溫度與誘變株Y-26產酶活力。誘變株Y-26置于不同溫度中，實驗不同溫度與誘變株Y-26產酶活力，結果見表9。

由表9知，在溫度為30℃～40℃范圍內酶活力較高，考慮到節省能源，選擇30℃為最佳發酵產酶溫度。

表9 培養溫度對誘變株Y-26產酶活力的影響

2.4 誘變株Y-26酶制劑脫囊衣工藝初步研究

以酶制劑用量（酶濃度/%）、料液比（g/mL）、處理時間（min）、酸濃度（%）、溫度（℃）為實驗因素，以砂囊得率為酶解囊衣效果評價指標，采用正交實驗法對發酵酶制劑脫囊衣工藝進行優化，實驗因素設計與水平見表10。

由表10可知，根據R值大小為E＞D＞B＞C＞A，即影響酶解臍橙囊衣得率的主次順序為溫度＞酸濃度＞料液比＞酶濃度＞時間；由表中K值分析可知酶解脫囊衣的最優工藝組合為A4B1C3D4E4，即酶解時間為120 min，料液比為1:2，酶添加濃度為5%，酸濃度為0.5‰，酶解溫度為50 ℃。因此，需要以該工藝條件為驗證試驗，最后的砂囊得率為48.4%，故經驗證實驗，A4B1C3D4E4為酶制劑脫囊衣的最佳工藝條件。

表10 正交實驗設計因素與水平表

3 結語

用傳統篩選和紫外誘變育種相結合技術手段，構建遺傳穩定、產酶活力高且對臍橙囊衣降解具有高度專一性的微生物——卷枝毛霉。初步確定臍橙脫囊衣專用產酶卷枝毛霉的發酵生產工藝條件，為工業化大規模生產該酶制劑提供理論參考。用該工藝生產的產品，不添加任何防腐劑，延長產品保質期，原有的酸堿脫囊衣技術將被徹底更新換代。通過改善臍橙橙汁胞加工工藝，促進資源節約和環境保護，降低生產成本，產品更具競爭力，產品質量更安全可靠，有利于出口。