基于網絡藥理學的補腎益心片治療高血壓分子機制研究

劉云娣 高佳珠 楊智華 麥喆钘 孫治中 李俊哲 溫俊茂

摘要：目的? 采用網絡藥理學方法分析補腎益心片治療高血壓的作用機制，為其臨床與應用提供參考。方法? 檢索中藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP）獲取補腎益心片活性成分，運用DRAR-CPI服務器、GeneCards和OMIM等數據庫篩選活性成分治療高血壓的作用靶點。采用Cytoscape3.6.0軟件構建補腎益心片活性成分-高血壓靶點網絡。結合String數據庫和Cytoscape的NetworkAnalyzer分析蛋白相互作用關系。采用Systems Dock Web Site進行活性成分與靶點分子對接。并進行GO分析、KEGG通路富集分析。結果? 篩選出補腎益心片活性成分30個，作用于62個靶點，主要通過調節腎素-血管緊張素系統、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路等發揮治療高血壓的作用。結論? 本研究初步揭示了補腎益心片治療高血壓的多成分、多靶點作用機制，可為后續研究提供參考。

關鍵詞：補腎益心片;高血壓;網絡藥理學;靶點;通路

中圖分類號：R2-05;R285??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0104-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.021????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To analyze the mechanism of Bushen Yixin Tablets （BYT） for hypertension based on network pharmacology; To provide references for clinic and application. Methods Active components in BYT were obtained by retrieving TCM systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP）. The active targets of BYT were screened by using databases such as DRAR-CPI， GeneCards and OMIM. Cytoscape3.6.0 was used to form the active components of BYT-hypertension targets network. String database and Cytoscape NetworkAnalyzer were used to analyze protein interactions. The System Dock Web Site was used to interface the active components with the target molecule. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted. Results Totally 30 active components of BYT and 62 target were obtained. BYT played the role of treating hypertension through regulating renin-angiotensin system. Toll-like receptor signaling pathway， PI3K-AKT signaling pathway and Jak-STAT signaling pathway. Conclusion This study preliminarily discloses the multi-component and multi-target mechanism of BYT for hypertension， which can provide references for further research.

Keywords： Bushen Yixin Tablets; hypertension; network pharmacology; targets; pathway

高血壓主要發生于中老年人群，但有逐漸呈年輕化趨勢。目前主要采用改善患者生活方式并配合藥物治療的方式，以達到將血壓降至正常血壓值的治療目標。但高血壓常伴多種并發癥，難以根治。

補腎益心片是廣州中醫藥大學第一附屬醫院多年來治療各種高血壓的常用中藥復方制劑。臨床觀察顯示補腎益心片可明顯改善患者生活質量、生理癥狀、性功能、工作狀態、生氣和活力、睡眠等方面的問題[1]。補腎益心片主要組成藥物為淫羊藿和車前子[2]。研究表明，補腎益心片可調節血壓，促一氧化氮合成、抗血小板聚集、利尿，對心、腦、腎等靶器官具有保護作用，還可使血漿過氧化脂質下降，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶回升，調節睪酮和雌二醇水平[2-3]。同時，補腎益心片對高血壓患者腎素-血管緊張素-醛固酮系統具有調節作用[4]。但目前研究大多關注藥物對個體和個別分子的影響，補腎益心片治療高血壓的有效活性成分及作用機制尚不明確。其藥理學研究仍處于單基因-單靶點研究階段，系統性研究鮮見報道。本研究采用網絡藥理學方法，分析補腎益心片的化學成分、作用靶點、信號通路，并進行GO分類富集分析及KEGG通路富集分析，分析“藥物-基因-靶點-疾病”間的關系，并進行可視化展示，為其臨床與應用提供參考。

1? 資料與方法

1.1? 藥物化學成分和活性成分的獲取

登錄中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP），分別以補腎益心片組成藥物“淫羊藿”“車前子”為關鍵詞檢索，獲得2種藥物的化學成分信息，包括成分編號（Mol ID）、分子量（MW）、脂水分配系數（AlogP）、氫鍵供體（Hdon）、氫鍵受體（Hacc）、口服生物利用度（OB）、Caco-2滲透率、血腦屏障（BBB）、類藥性（DL）、負分數可表達面積（FASA-）?？紤]到中藥成分紛繁復雜，必非所有成分均能進入體內發揮作用，選取同時滿足OB>30%、DL>0.18的化學成分，作為其活性成分。

1.2? 活性成分作用靶點獲取

利用Discovery Studio 4.0對成分進行預處理，選擇Minimize ligands模塊，在CHARMm力場下采用共軛梯度法與最陡下降法相結合的能量優化算法，進行成分的能量最小化分析。然后采用BEST模式對分子進行多構象的生成。通過Chembiodraw Ultra 12.0軟件繪制出淫羊藿-車前子的活性成分3D結構圖，以mol2格式保存。

將活性分子的3D結構上傳到DRAR-CPI服務器（http：//cpi.bio-x.cn/drar/），基于反向分子對接方法，對活性成分和蛋白相互作用的親和性進行打分。按照服務器推薦，選定Z-score<-0.5的蛋白作為淫羊藿-車前子活性分子的預測靶點。通過UniProtKB數據庫（https：//www.uniprot.org/）檢索淫羊藿-車前子活性分子預測靶點的PDB ID，檢索字段為“All Fields”，限定物種為“human（人）”，以獲取預測靶點相應基因。

1.3? 高血壓相關靶點基因獲取

分別在GeneCards數據庫（https：//www.genecards. org/）和OMIM數據庫（https：//www.omim.org/）以“hypertension”或“HTN”為關鍵詞檢索與高血壓病相關的靶點基因。將相關的靶點基因和淫羊藿-車前子活性分子的預測靶點基因錄入Excel表格，進行兩者的對比，篩選出共同部分，作為淫羊藿-車前子活性成分抗高血壓的潛在作用靶點。

1.4? 活性成分-作用靶點網絡構建

將補腎益心片活性成分與抗高血壓作用靶點導入Cytoscape3.6.0軟件，構建活性成分-作用靶點網絡。

1.5? 核心靶點相互作用網絡構建與分析

以String數據庫（https：//string-db.org/）為背景網絡數據庫，將補腎益心片活性分子抗高血壓的潛在靶點導入String數據庫，限定物種為“homo sapiens”，檢索獲得蛋白相互作用關系，以TSV格式保存結果。再將其導入Cytoscape3.6.0軟件繪制蛋白相互作用關系網絡，并用Cytoscape的NetworkAnalyzer工具進行網絡分析，根據degree值（連接度）調節節點的大小、顏色，以獲取最終的蛋白相互作用網絡。

1.6? 分子對接

通過System Dock Web Site進行分子對接得出的Docking評分，可評估配體-受體的結合潛力[5]。因此，基于上述的蛋白相互作用網絡，篩選出degree值最高的5個靶點，并導入System Dock Web Site服務器（http：//systemsdock. unit.oist.jp/iddp/home/index），按照服務器原始參數設定，與淫羊藿-車前子活性分子進行對接。通過對結果的Docking評分進行分析，評估活性分子與核心靶點之間的結合潛力。

1.7? 生物學過程與信號通路分析

DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）為大量基因或蛋白提供系統全面的生物功能注釋信息，并能找出最顯著富集的生物學注釋[6]。將補腎益心片活性分子作用靶點導入DAVID數據庫，Select Identifier 設為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 設為“Gene List”，限定物種為“human”，進行GO分析和KEGG信號通路富集分析，得到并保存結果。選取滿足P<0.001的通路和生物過程，并根據富集基因數的大小，選取排名前20位的信號通路，使用OmicShare網站（http：//www.omicshare. com/）繪圖。

1.8? 成分-靶點-通路網絡構建

通過分析富集基因數排名前20位的KEGG信號通路，結合相關文獻檢索，篩選出可能與抗高血壓相關的信號通路，找出富集在這些通路上淫羊藿-車前子抗高血壓的靶點，并與相應藥物的活性分子相配對，構建成分-靶點-通路網絡。

2? 結果

2.1? 補腎益心片活性成分

TCMSP收集到淫羊藿化學成分130個，車前子化學成分55個。經篩選，得到活性成分30個，其中淫羊藿活性成分23個、車前子活性成分9個，如木犀草素（luteolin）、槲皮苷（quercetin）、谷甾醇（sitosterol）、山柰酚（kaempferol）和高車前苷元（Dinatin）等，見表1。

2.2? 靶點預測

30個活性成分在DRAR-CPI服務器中得到Z-score<-0.5的靶點有62個，在UniProtKB數據庫中輸入這些蛋白靶點的PDB ID，獲得62個基因靶點。再與OMIM與GeneCards數據庫的高血壓相關靶點基因進行比對，篩選出與高血壓相關的作用靶點62個，見表2。

2.3? 活性成分-靶點網絡

在Cytoscape3.6.0軟件中導入活性成分與作用靶點的信息及對應關系，構建活性成分-靶點網絡，見圖1。此網絡包括92個節點、487條邊。節點代表活性成分與作用靶點，而邊則代表成分與靶點之間存在相關關系。不同的靶點可對應同一個的活性成分，單個靶點也可與不同的活性成分相對應，由此可見淫羊藿-車前子治療高血壓具有多成分、多靶點的特點。

2.4? 核心靶點相互作用網絡

將62個潛在靶點導入String數據庫中，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關系，使用Cytoscape3.6.0軟件繪制相互作用網絡，見圖2。此網絡共包括62個節點、352條邊。圖中節點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關聯。degree值越大則節點越大、顏色越深，結果提示degree值最高的5個潛在靶點分別是IL-6、VEGFA、TNF、EDN1、TGFB1。

2.5? 分子對接結果

degree值高意味著該蛋白在補腎益心片活性分子治療高血壓中具有重要作用。在Systems Dock Web Site服務器中輸入關鍵靶點TNF、IL-6、VEGFA、EDN1、TGFB1的PDB ID，并與30個活性成分進行對接（見圖3）。結果顯示有18個的Docking評分>7.0，有79個在7.0～5.0之間，有45個在5.0～4.25之間，<4.25的18個。當Docking評分>4.25時表示分子和靶點具有一定結合能力，>5.0時表示結合能力較高，>7.0時表示結合能力高。由此可見，補腎益心片的活性成分和關鍵靶點的結合能力良好。

2.6? GO分析和KEGG通路富集分析結果

對潛在靶點進行GO分析和KEGG分析，以P<0.01為閾值篩選富集數量較多的通路與生物過程，其中富集占相應通路比例越大、P值越小的通路，與補腎益心片活性分子治療高血壓的關系更密切。GO分析和KEGG通路富集分析結果見圖4～圖7。風險系數為富集在該通路的靶點與通路靶點總數的比值。

2.7? 活性成分-靶點-信號通路網絡

從KEGG結果排名前20位的信號通路中篩選出可能與高血壓相關的5條，并將其與補腎益心片的活性成分、作用靶點一一對應，構建成分-靶點-通路多維網絡，見圖8。由圖分析可得，補腎益心片治療高血壓涉及的活性成分共10個，包括木犀草素、槲皮苷、谷甾醇等，靶點有TNF、IL-6、VEGFA等，主要涉及腎素-血管緊張素系統、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路。

3? 討論

補腎益心片中淫羊藿性溫，具有補腎壯陽之功;車前子性寒，具有清肝利水等作用。二藥合用，一溫一寒，一補一清，具有補腎清肝的功效。

本研究收集到補腎益心片組成中具有治療高血壓作用的活性成分共30個，如木犀草素、槲皮苷、谷甾醇、山柰酚和高車前苷元等。通過30個活性成分收集到可能與高血壓相關的作用靶點62個。表明補腎益心片治療高血壓具有多成分、多靶點特點。成分-靶點網絡也體現了該特點。此外，靶點相互作用網絡呈現出補腎益心片活性分子治療高血壓的各蛋白靶點之間關系密切，提示其作用機制復雜多樣，非單一蛋白靶點作用而成。分子對接試驗顯示，補腎益心片活性成分和關鍵靶點之間結合能力良好，說明本研究數據及結果準確度較高，在此基礎上進行網絡分析結果具一定參考價值。

GO和KEGG通路富集分析與成分-靶點-通路網絡結果顯示，補腎益心片治療高血壓涉及腎素-血管緊張素系統、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路等。

腎素-血管緊張素系統人體重要的體液調節系統，調節血壓和水-電解質平衡。機體可合成血管緊張素Ⅰ，進而合成血管緊張素Ⅱ，然后激活其AT1受體，發揮收縮血管、再吸收腎鈉離子、分泌醛固酮、增加血壓和促進高血壓發生的作用。因此抑制腎素-血管緊張素系統可有效治療高血壓，補腎益心片可能通過影響機體腎素-血管緊張素系統改善高血壓的病理狀態。

Toll樣受體信號通路中TLR4介導的先天及適應性免疫反應參與高血壓慢性血管炎性反應，其對血壓調控的機制主要與TLR4介導內皮細胞炎性損傷及血管反應性增強有關[7]。TLR4的表達增強可升高血壓，而抑制TLR4可降低血壓。通路分析結果顯示，補腎益心片可能通過影響TLR4的表達起到治療高血壓的作用。

延髓頭端腹外側區（RVLM）是交感神經調控的關鍵中樞，在維持基礎血壓和保持交感神經緊張中具有重要作用。此中樞內PI3K-AKT信號通路參與了血壓的調節。在高血壓大鼠RVLM中PI3K通路明顯上調，其失活導致RVLM內活性氧簇產生減少，改善高血壓心血管功能[8]。本研究結果提示，淫羊藿-車前子可能通過影響PI3K-AKT信號通路而治療高血壓。

Jak-STAT信號通路是大多數細胞因子及活性物質發揮生物作用的共同通路。血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1）自身抗體AT1-AAs有促細胞增殖的作用，而Jak-STAT信號通路的激活參與了AT1-AAs所致的血管平滑肌細胞增殖效應，從而參與了高血壓病的發生發展[9]。補腎益心片可能影響Jak-STAT信號通路的激活，起到治療高血壓的作用。

綜上，補腎益心片治療高血壓涉及多種活性成分、作用靶點及信號通路。本研究通過分子對接驗證了檢索數據，所得結果與現有文獻報道符合，但該研究結果還需進一步實驗驗證。

參考文獻：

[1] 吳偉，陳宏，郭力恒，等.補腎益心片對高血壓病患者生活質量的影響[J].新中醫，2002，32（8）：32-33.

[2] 黃火劍.補腎益心片對原發性高血壓患者的治療作用及其機制研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2011.

[3] 吳偉，劉煜德，陳宏珪，等.補腎益心片對腎血管性高血壓大鼠的降壓作用及保護靶器官的研究[J].廣州中醫藥大學學報，2001，18（1）：63- 66.

[4] 劉煜德，吳偉，陳宏珪，等.補腎益心片對腎性高血壓大鼠血漿過氧化脂質及性激素的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2001，12（6）：426-427， 452.

[5] LUO H， CHEN J， SHI L， et al. DRAR-CPI：a server for identifying drug repositioning potential and adverse drug reactions via the chemical-protein interactome[J]. Nucleic Acids Res，2011，39：492-498.

[6] VON MERING C， JENSEN L J， SNEL B， et al. STRING：known and predicted protein-protein associations， integrated and transferred across organisms[J]. Nucleic Acids Res，2005，33：433-437.

[7] HSIN K Y， MATSUOKA Y， ASAI Y， et al. Systems dock：a web server for network pharmacology-based prediction and analysis[J]. Nucleic Acids Res，2016，44：507-513.

[8] DENNIS G J R， SHERMAN B T， HOSACK D A， et al. DAVID：Database for annotation， visualization， and integrated discovery[J]. Genome Biol，2003，4：3.

[9] 孫艷香.原發性高血壓患者血清中抗AT1受體自身抗體的生物學效應及其產生機制研究[D].武漢：華中科技大學，2009.

（收稿日期：2019-01-13）

（修回日期：2019-02-28;編輯：向宇雁）