解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠TLR3/TNF-α/JNK2信號通路的影響

王茜 王亞芬 張一昕 石鋮 郭秋紅 韓雪 郝蕾

摘要：目的? 觀察解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠TLR3/TNF-α/JNK2信號通路的影響。方法? 采用對乙酰氨基酚灌胃制作大鼠肝損傷模型。將實驗大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和解毒護肝方高、中、低劑量組，各給藥組給予相應藥液灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。生化分析儀檢測血清AST、ALT活性和總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）含量;RT-PCR和Western blot分別檢測肝組織JNK2基因和蛋白的表達;酶標儀檢測肝組織勻漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）含量;免疫組化染色觀察Toll樣受體3（TLR3）蛋白表達。結果? 與正常組比較，模型組大鼠ALT、AST、DBIL、TNF-α水平顯著升高（P<0.01），JNK2 mRNA和p-JNK2、TLR3蛋白表達顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，解毒護肝方中、低劑量組大鼠AST、ALT活性顯著降低（P<0.05，P<0.01），解毒護肝方低劑量組大鼠DBIL含量顯著降低（P<0.05），解毒護肝方高劑量組大鼠TNF-α含量顯著降低（P<0.01），解毒護肝方高、中劑量組大鼠JNK mRNA和TLR3蛋白表達均顯著下調（P<0.05，P<0.01），p-JNK2蛋白表達有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。結論? 解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠有明顯的保護作用，以中、低劑量組效果最為明顯，其機制可能與調控TLR3/TNF-α/JNK2信號通路有關。

關鍵詞：解毒護肝方;對乙酰氨基酚;藥物性肝損傷;JNK2;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0060-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.013????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Jiedu Hugan Prescription on TLR3/TNF-α/JNK2 signaling pathway of acetaminophen-induced hepatotoxicity rats. Methods Hepatotoxicity rat model was prepared by intragastric administration of acetaminophen. The rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group， Jiedu Hugan Prescription high-， medium- and low-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine infusions for gavage， normal group and model group were given normal saline for gavage. At the end of the experiment， the levels of AST， ALT， TBIL and DBIL were detected by biomedical analyzer. JNK2 gene and protein expression in liver tissue were detected by RT-PCR and Western blot. The contents of TNF-α and IL-6 in liver tissue homogenate were detected by enzyme microplate reader. The expression of Toll-like receptor 3 （TLR3） protein was observed by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the levels of ALT， AST， DBIL and TNF-α in the model group significantly increased （P<0.01）， and the expressions of JNK2 mRNA， p-JNK2， and TLR3 protein significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the activities of AST and ALT in Jiedu Hugan Prescription medium- and low-dosage groups significantly decreased （P<0.05， P<0.01）; the content of DBIL level in Jiedu Hugan Prescription low-dosage group significantly decreased （P<0.05）; the content of TNF-α in Jiedu Hugan Prescription high-dosage group significantly decreased （P<0.01）. The expressions of JNK mRNA and TLR3 protein in Jiedu Hugan Prescription high- and medium-dosage groups were significantly down-regulated （P<0.05， P<0.01）， and the expression of p-JNK2 protein decreased， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion Jiedu Hugan Prescription has obvious protective effects on rats with drug-induced hepatotoxicity， and the effects are most obvious in the medium- and low-dosage groups. The mechanism may be related to the regulation of TLR3/TNF-α/JNK2 signaling pathway.

Keywords： Jiedu Hugan Prescription; acetaminophen; drug-induced hepatotoxicity; JNK2; rats

臨床上，對乙酰氨基酚（APAP）是應用廣泛的解熱鎮痛藥，但其大劑量服用或聯合使用則會誘發藥物性肝損傷，嚴重者可導致肝衰竭甚至死亡。據美國食品藥品監督管理局統計，過量服用含APAP的藥品是導致患者肝衰竭最主要的因素[1]。JNK2為c-Jun氨基末端激酶（JNK）的亞型之一，幾乎在所有的細胞中均有表達。研究表明，JNK2基因敲除對腫瘤壞死因子（TNF）介導的肝細胞損傷具有保護作用，從而推測JNK2在APAP誘導的肝損傷中發揮重要作用[2-4]。中醫學根據藥物性肝損傷的臨床特點，將其歸屬于“黃疸”“積聚”等范疇，而肝失疏泄、氣滯血瘀、脾失健運、濕濁內生為其主要的發病機制，疏肝健脾、活血祛瘀、解毒除濕為其有效治法。基于上述認識，本課題組自擬解毒護肝方，該方由逍遙丸、茵陳蒿湯、小柴胡湯三方加減化裁而成，具有疏肝健脾、除濕解毒、活血祛瘀功效，臨床用于防治藥物性肝損傷具有一定的療效。為進一步探討其作用機制，本實驗采用APAP灌胃制作大鼠肝損傷模型，觀察解毒護肝方對模型大鼠TLR3/TNF-α/JNK2信號通路的影響。

1? 材料與方法

1.1? 動物

清潔級Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質量180～220 g，北京維通利華生物技術有限公司提供，動物質量合格證號11400700181914，動物生產許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心動物室（萬級潔凈屏障系統），溫度（23±2）℃，相對濕度60%～70%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

解毒護肝方（柴胡10 g，醋香附15 g，白術10 g，炒白芍15 g，五味子10 g，黃芪15 g，茵陳15 g，黃芩10 g，丹參15 g，楮實子10 g，田基黃15 g，甘草10 g），飲片均為免煎顆粒，四川新綠色藥業科技發展有限公司。水飛薊賓膠囊（每粒含水飛薊賓35 mg，批號750709172），天津天士力圣特制藥有限公司;對乙酰氨基酚片（每片含APAP 0.5 g，批號016171002），石藥集團歐意藥業有限公司。

1.3? 主要試劑與儀器

AST測定試劑盒（批號AUZ3645）、ALT測定試劑盒（批號AUZ3689），貝克曼庫爾特實驗系統有限公司;總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號A005）、直接膽紅素（DBIL）試劑盒（批號A006），長春匯力生物技術有限公司;TNF-α（批號T15030357）、白細胞介素-6（IL-6，批號S01030358），武漢華美生物工程有限公司;Trizol（批號139603），Invitrogen公司;TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（批號P5011）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green，批號Q5922），天根生化科技（北京）有限公司;JNK2兔多抗、p-JNK2（Tyr185）兔單抗，Cell Signaling Technology公司;β-actin小鼠單抗、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）、Peroxidase-Conjugated Goat anti-Rabbit IgG（H+L）、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG（H+L）、TLR3兔多抗（批號00009333）、二抗（Goat，批號K186817A），DAB（批號K186916P），北京中杉金橋生物技術有限公司。Humalyzer2000半自動生化儀（德國豪邁），DP73數碼顯微鏡（日本Olympus），HMIAS-2000顯微圖像分析系統（武漢同濟醫科大學），酶標儀（BioTek，ELx800），熒光定量PCR儀ABI7500（Applied Biosystems），電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），生物分光光度計（Eppendorf），電泳槽（美國BioRad），轉移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司），Tanon Gis電泳圖像分析系統（Tanon1600），Quantity one分析軟件（Bio Rad Technical Service Department）。

1.4? 造模、分組和給藥

大鼠每日灌胃APAP 1200 mg/kg藥液（40 ℃生理鹽水配制）1次，連續30 d，制作大鼠肝損傷模型[5-6]。將成模大鼠按體質量隨機分為模型組、陽性對照組和解毒護肝方高、中、低劑量組，每組12只，另取10只大鼠為正常組，雌雄各半。解毒護肝方高、中、低劑量組分別給予63、31.5、15.75 g原藥材/kg藥液灌胃，陽性對照組給予水飛薊賓（44 mg/kg）藥液灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續30 d。實驗期間每7 d稱重1次，自由攝食飲水。

1.5? 標本制備

實驗結束后，大鼠3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，全血分別置于清潔試管中，4000 r/min離心10 min，分離血清，分裝置于-80 ℃冰箱保存，待檢相關肝功能指標。取血后迅速取固定部位肝組織3份，1份置于4%多聚甲醛液中固定，用于肝組織病理形態觀察，另2份置于凍存管，液氮凍存，-80 ℃冰箱保存，用于JNK2基因和蛋白的表達、肝勻漿上清液TNF-α和IL-6含量的測定。

1.6? 指標檢測

1.6.1? 一般觀察

給藥后觀察大鼠精神狀態、行為活動、飲食情況、二便情況和皮膚毛色。

1.6.2? 生化指標檢測

應用半自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、TBIL、DBIL含量;應用酶標儀檢測肝勻漿TNF-α和IL-6的含量。上述操作均按試劑盒說明書進行。

1.6.3? 病理形態觀察

取4%多聚甲醛溶液固定肝組織，常規脫水、包埋、切片、HE染色，鏡下觀察。

1.6.4? RT-PCR檢測肝組織JNK2基因的表達

用Trizol提取組織樣本中總RNA。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA的完整性。引物序列由Primer5.0軟件設計。β-actin上游引物5'-CCT CCTGAACTTGAGGCAGTTTA-3'，下游引物5'-CTCT GGGGCTGTCAGTCTTG-3';JNK2上游引物5'-GACA GTAAAAGCGATGGC-3'，下游引物5'-TTGGTTCTG AAAAGGACG-3'。擴增片段均為638 bp。用TIANScript RT KIT進行反轉錄，實驗操作按產品說明書進行。用熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數據相對定量分析，ΔΔCt=（待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值）÷（對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值）。

1.6.5? Western blot檢測肝組織JNK2蛋白的表達

取約100 mg組織加液氮研磨成粉末，加入1 mL裂解液（裂解液中含有臨時加入的10 μL蛋白酶抑制劑混合物），研磨，直至成為液體，轉至EP管，冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。根據蛋白定量結果，加入相應體積總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液，混合，95 ℃變性10 min，將樣品加至凝膠孔中，進行凝膠電泳。凝膠電泳結束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶轉印至PVDF膜，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。取上清液，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃中煮沸5 min。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣等量總蛋白。利用水浴式電印跡法將蛋白轉移至膜上。室溫振蕩封閉膜1 h，將一抗用封閉液稀釋1000倍;將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反應過夜，將反應膜放入平皿中，用1×TBST洗滌3次，每次10 min，洗凈未結合的一抗。將二抗用1×TBST稀釋3000倍;將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中（室溫、避光緩慢搖動）作用60 min。用1×TBST洗滌3次，每次10 min，洗去游離二抗。按1∶1（V/V）混合ECL試劑盒中2種液體，再將混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒，曝光并洗片，最后采用Tanon1600對膠片進行掃描，用Tanon Gis軟件分析，系統自動生成灰度值。

1.6.6? 免疫組化檢測肝組織Toll樣受體3蛋白的表達

采用免疫組化方法觀察，每組取6只大鼠，每例測5個視野。由計算機算出所測陽性反應物相對含量的積分光密度（IOD）和平均光密度（MOD）。

1.7? 統計學方法

采用SPSS13.5統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，采用方差分析，方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用DunnettT3檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 一般狀況

正常組大鼠毛發滑順、有光澤，精神狀態良好，行動靈活，二便正常;模型組大鼠體質量減輕，毛發無光澤，精神狀態欠佳，喜臥;各給藥組大鼠毛發光澤度、精神狀態、體質量及行動靈活性均有改善。

2.2? 解毒護肝方對模型大鼠血清肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠ALT、AST、DBIL水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和解毒護肝方中、低劑量組大鼠ALT、AST活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），解毒護肝方低劑量組大鼠DBIL含量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與解毒護肝方高劑量組比較，解毒護肝方中劑量組大鼠ALT、AST活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表1。

2.3? 解毒護肝方對模型大鼠肝組織病理形態的影響

正常組大鼠肝細胞排列整齊，圍繞中央靜脈放射狀排列，細胞核形態正常，胞漿均勻，無變性及壞死;模型組大鼠肝細胞排列紊亂，細胞呈現廣泛水腫變性，散在少量點狀壞死;解毒護肝方高、中、低劑量組較模型組大鼠細胞結構紊亂有不同程度的改善，局部細胞水腫變性，未觀察到點狀壞死，以中、低劑量組改善尤為明顯。結果見圖1。

2.4? 解毒護肝方對模型大鼠肝組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和解毒護肝方高劑量組大鼠肝組織TNF-α含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）;各給藥組大鼠肝組織IL-6含量差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

2.5? 解毒護肝方對模型大鼠肝組織JNK2基因和蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織JNK2 mRNA和p-JNK2蛋白表達顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，解毒護肝方各劑量組大鼠肝組織JNK2 mRNA表達顯著降低（P<0.01），p-JNK2蛋白表達有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）;與陽性對照組比較，解毒護肝方中、低劑量組大鼠肝組織JNK2 mRNA和p-JNK2蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表3、圖2。

2.6? 解毒護肝方對模型大鼠肝組織Toll樣受體3蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織TLR3蛋白IOD、MOD值均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和解毒護肝方高、中劑量組大鼠肝組織TLR3蛋白IOD、MOD值均顯著降低（P<0.01）;與解毒護肝方低劑量組比較，陽性對照組和解毒護肝方高、中劑量組大鼠肝組織TLR3蛋白IOD、MOD值均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表4、圖3。

3? 討論

臨床上常用ALT和AST作為反映肝細胞損傷程度的生化指標。正常情況下，二者在血清中含量很低，但當肝細胞受到損傷時，細胞發生變性及壞死，細胞膜通透性增加或發生崩解，ALT、AST釋放入血，血中ALT、AST活性升高。

DBIL能溶于水，可通過腎臟隨尿液排出體外。在發生廣泛的肝損傷或直接抑制膽汁轉運蛋白時會使TBIL含量升高。當發生紅細胞破壞過多或肝細胞對膽紅素出現轉運、結合、排泄缺陷以及膽管阻塞時，亦可導致膽紅素代謝障礙。實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織ALT、AST、DBIL水平顯著升高，提示肝損傷模型建立成功;與模型組比較，陽性對照組和解毒護肝方中、低劑量組均能顯著降低大鼠肝組織ALT、AST活性，解毒護肝方低劑量組又能顯著降低大鼠肝組織DBIL含量;各給藥組均能不同程度降低大鼠肝組織TBIL含量，但各組間差異無統計學意義（P>0.05）。提示各給藥組對損傷的肝細胞均有不同程度的改善作用，尤以解毒護肝方中、低劑量組效果為佳。

有研究顯示，炎癥因子參與了APAP所致肝損傷的發生、發展過程。主要由APAP代謝產物N-乙酰-對-苯醌亞胺與肝臟中蛋白酶結合形成毒性物質，刺激肝Kupffer細胞產生并釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，其中TNF-α主要參與調控炎癥發生和細胞凋亡，被認為是炎癥反應過程中出現最早的炎癥介質[7-8]。而JNK2在TNF-α誘導的細胞凋亡中及APAP所致的肝損傷中發揮重要作用[9]。有研究顯示，JNK2基因缺失的肝細胞比野生細胞或JNK1基因缺失肝細胞更耐TNF-α誘導的細胞凋亡，且對APAP引起的肝損傷表現出部分的保護作用[10-12]。也有研究發現，TLR3基因敲除小鼠也能免疫APAP所致的肝損傷，TLR3能增強TNF-α的表達及磷酸化JNK在APAP傷肝臟中的表達[13]。本實驗結果顯示，各組大鼠肝組織IL-6水平差異無統計學意義（P>0.05），模型組大鼠肝組織TNF-α含量、JNK2基因和蛋白表達及TLR3的表達顯著升高，解毒護肝方各劑量組均能不同程度的降低肝組織TNF-α含量，下調肝組織JNK2基因和蛋白表達，減少肝組織TLR3的陽性表達，其中解毒護肝方高劑量組能顯著降低肝組織TNF-α含量，解毒護肝方高、中劑量組均能顯著降低TLR3的陽性表達，解毒護肝方各劑量組均能顯著降低JNK2的基因表達，而對p-JNK2蛋白表達僅有降低趨勢，差異未見統計學意義，可能是由于本實驗中APAP所致肝損傷對JNK2的影響尚處在轉錄階段，從而未產生明顯蛋白水平的變化，后續擬增加造模劑量和延長給藥時間繼續探討其對JNK2蛋白水平的影響。

綜上，本研究結果表明，解毒護肝方各劑量組均有一定的護肝作用，其機制主要通過抑制TLR3的表達，從而抑制促炎因子TNF-α的產生，下調JNK2基因的表達來實現護肝作用。但實驗結果顯示，解毒護肝方中、低劑量組能顯著降低血清肝功能指標，而解毒護肝方高劑量組對肝組織TNF-α含量、JNK2基因表達有很好的調節作用，解毒護肝方高、中劑量組對TLR3的表達有較好的調節作用，結合肝組織病理形態學變化，解毒護肝方高劑量組肝臟病理變化較中、低劑量組嚴重。本實驗中解毒護肝方低劑量為臨床等效劑量，中劑量為等效劑量的2倍，高劑量為等效劑量的4倍，筆者認為，基于臨床合理安全用藥的原則，雖然高劑量組對早期炎癥因子和基因水平均有較好的調節作用，但由于劑量較大也加重了肝臟的負擔，故在中、低劑量也有一定療效的情況下，選擇相對較低的劑量治療疾病更符合臨床安全用藥的需求。

參考文獻：

[1] JAESCHKE H. Acetaminophen：dose-dependent drug hepatotoxicity and acute liver failure in patients[J]. Digestive Diseases，2015， 33（4）：464-471.

[2] CUBERO F J， ZOUBEK M E， HU W， et al. Combined activities of JNK1 and JNK2 in hepatocytes protect against toxic liver injury[J]. Gastroenterology，2016，150（4）：968-981.

[3] SEKI E， BRENNER D A， KARIN M， et al. C57BL/6 substrains of genetically engineered mice and wild-type controls can lead to confounding results as it did in studies of JNK2 in acetaminophen and concanavalin a liver injury[J]. Chem Res Toxicol，2011，24（6）：794-796.

[4] MOHAMMED B， MIDHUN C， CHAKRABORTY M， et al. Protective role of c-Jun N-terminal kinase 2 in acetaminophen induced liver injury[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，374（1）：6-10.

[5] 張蕾，詹俊，伍百賀，等.TNF-α在對乙酰氨基酚所致大鼠藥物性肝損傷中的作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2014，23（10）：1181-1183.

[6] 王雁，湯納平，富欣，等.對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷大鼠血漿miR-122表達的變化[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（5）：854- 859.

[7] 張蕾，詹俊，伍百賀，等.TNF-α在對乙酰氨基酚所致大鼠藥物性肝損傷中的作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2014，23（10）：1181-1183.

[8] KNOCKAERT L， DESCATOIRE V， VADROT N， et al. Mitochondrial CYP2E1 is sufficient to mediate oxidative stress and cytotoxicity induced by ethanol and acetaminophen[J]. Toxicol in Vitro， 2011，25（2）：475-484.

[9] JAVELAUD D， BESANCON F. NF-κB activation results in rapid inactivation of JNK in TNF-α-treated Ewing sarcoma cells： a mechanism for the anti-apoptotic effect of NF-κB[J]. Oncogene， 2001，20（32）：4365-4372.

[10] WAGNER E F， NEBREDA A R. Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development[J]. Nat Rev Cancer，2009，9（8）：537-549.

[11] KODAMA Y， TAURA K， MIURA K， et al. Antiapoptotic effect of c-Jun N-terminal Kinase-1 through Mcl-1 stabilization in TNF-induced hepatocyte apoptosis[J]. Gastroenterology，2009，136（4）：1423-1434.

[12] GUNAWAN B K， LIU Z X， HAN D， et al. c-Jun n-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity[J]. Gastroenterology，2006，131（1）：165-178.

[13] CAVASSANI K A， MOREIRA A P， HABIEL D， et al. Toll like receptor 3 plays a critical role in the progression and severity of acetaminophen-induced hepatotoxicity[J]. PLoS One，2013，8（6）：e65899.

（收稿日期：2019-01-18）

（修回日期：2019-03-21;編輯：華強）