丹紅注射液對動脈粥樣硬化小鼠主動脈自噬基因Atg13啟動子區甲基化及PI3K/Akt/mTORC1信號通路的影響

周明學 李思耐 劉衛紅 尚菊菊 劉紅旭

摘要：目的? 觀察丹紅注射液對動脈粥樣硬化（AS）小鼠自噬基因Atg13啟動子區甲基化及自噬信號通路PI3K/Akt/mTORC1的影響，探討其可能的作用機制。方法? 40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養6周，隨機分為模型組、陽性對照組和丹紅注射液低、高劑量組，每組10只，各給藥組給予相應藥物干預。6周后RT-PCR檢測AS小鼠主動脈自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表達;Western blot檢測AS小鼠主動脈Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt、mTORC1和p-mTORC1的蛋白表達;采用亞硫酸氫鹽測序法檢測AS小鼠主動脈自噬基因Atg13啟動子區甲基化水平。結果? 與模型組比較，丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動脈Beclin1蛋白表達明顯升高，丹紅注射液低劑量組小鼠主動脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達明顯升高（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動脈Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達顯著升高（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動脈自噬基因Atg13啟動子區甲基化水平明顯降低（P<0.01），丹紅注射液高、低劑量組小鼠主動脈p-Akt蛋白表達明顯降低（P<0.01），丹紅注射液高劑量組小鼠主動脈p-mTORC1蛋白表達明顯降低（P<0.01）。結論? 丹紅注射液防治AS的機制可能與降低模型小鼠主動脈Atg13啟動子區甲基化水平、抑制PI3K/Akt/mTORC1信號通路和促進細胞自噬有關。

關鍵詞：動脈粥樣硬化;丹紅注射液;自噬;DNA甲基化;Atg13;PI3K/Akt/mTORC1信號通路;小鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0046-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.010????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To study the effects of Danhong Injection on methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 and autophagy signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 in atherosclerotic （AS） mice， to explore possible action mechanism. Methods Totally forty eight-week-old male ApoE-/- mice were fed with high-fat diet for 6 weeks. They were randomly divided into model group， positive control group， Danhong Injection low- and high-dosage groups （n=10）. The administration groups were given the corresponding drug for intervention. After 6 weeks， the mRNA expressions of the autophagy genes Atg13， Atg3 and Atg4a in AS mice were detected by RT-PCR; Western blot method was used to detect the protein expressions of Beclin1， LC3Ⅱ/Ⅰ， PI3K， p-Akt， mTORC1 and p-mTORC1 in the aorta of AS mice; Methylation level of the promoter region of autophagy gene Atg13 in the aorta of AS mice was detected by bisulfile sequencing PCR. Results Compared with model group， the protein expressions of Beclin1 in aorta of Danhong Injection groups significantly increased， LC3Ⅱ/Ⅰ expressions in aorta of Danhong Injection low-dosage group significantly increased （P<0.01）， and the mRNA expressions of Atg13， Atg3 and Atg4a in Danhong Injection groups also increased significantly （P<0.01）; The level of methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 in Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， and the protein expressions of p-Akt in aorta of Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， the protein expressions of p-mTORC1 Danhong Injection in aorta of Danhong Injection groups high-dosage groups significantly decreased （P<0.01）. Conclusion The mechanism of Danhong Injection in preventing and treating AS may be related to decrease of methylation level of Atg13 in the promoter region in the aorta of model mice， reducing signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 and promoting autophagy.

Keywords： atherosclerosis; Danhong Injection; autophagy; DNA methylation; Atg13; signaling pathway of PI3K/Akt/mTORC1; mice

丹紅注射液是從紅花和丹參中提取純化制作而成的中藥復方制劑，具有通脈舒絡、活血化瘀功效，臨床上廣泛應用于動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）性心腦血管疾病的治療，具有保護血管內皮、抗炎、抗血栓、抗凋亡和神經保護等藥理作用。我們既往研究結果表明，丹紅注射液明顯抑制AS，可能與DNA甲基化調控有關[1]，但具體機制尚不清楚。適度自噬對AS具有保護作用，通過自噬降解細胞內受損結構，以適應炎癥、缺氧等環境改變[2]。DNA甲基化是AS發生的重要機制之一[3]，自噬基因及其相關信號通路基因出現甲基化修飾異常，可影響自噬，導致AS發生[4]。因此，本研究以高脂喂養的ApoE-/-小鼠為觀察對象，觀察丹紅注射液對ApoE-/-小鼠AS主動脈自噬標志性基因和信號通路的干預作用，并通過檢測Atg13啟動子區甲基化水平，探討丹紅注射液抗AS可能的DNA甲基化機制。

1? 材料與方法

1.1? 動物及飼料

6～8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J）40只，體質量18～20 g，北京維通利華實驗技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于溫度20～26 ℃、相對濕度40%～70%環境，光照12 h明暗交替。高脂飼料配方為脂肪21%（W/W）、膽固醇0.15%西方類型膳食飼料。

1.2? 藥物

丹紅注射液，山東丹紅制藥有限公司，批號16071028;阿托伐他汀鈣片，上海輝瑞制藥公司，批號017112K。

1.3? 主要試劑與儀器

Beclin1抗體（批號ab62557）、LC3Ⅱ蛋白激酶B抗體（批號ab48394）、PI3K抗體（批號ab182651）、AKT1抗體（磷酸化位點S473，批號ab18206）、mTORC1抗體（批號ab32028）、p-mTORC1抗體（Ser2448，批號ab109268），美國Abcam公司;甲基化DNA檢測試劑盒（批號CW2140）、DNA純化回收試劑盒（批號CW0524）、T載體連接試劑盒（批號CW0801），北京康為世紀生物科技有限公司;qPCR試劑盒（KK4601），KAPABiosystems。SMA-1000分光光度計（美林恒通），JY300C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），K960PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司），實時定量PCR儀（ABI公司）。

1.4? 分組和給藥

實驗小鼠高脂飼料飼養6周后，隨機分為模型組、陽性對照組（3.34 mg/kg）和丹紅注射液高（6 mL/kg）、低（3 mL/kg）劑量組（丹紅高、低劑量組），每組10只。丹紅高、低劑量分別為臨床常用劑量的1、0.5倍，并按人與動物給藥劑量換算系數折算成小鼠用量灌胃給藥[5]，陽性對照組給予阿托伐他汀鈣片藥液灌胃（3.34 mg/kg），模型組給予等量生理鹽水灌胃;每日1次，連續6周;12周后脫頸處死小鼠，取主動脈液氮驟冷，-80 ℃冰箱保存備用。

1.5? RT-PCR檢測

分離總RNA，取2 μg RNA，使用第一鏈cDNA試劑盒在10.5 μL體系（50 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL、4 μL 5×buffer、2 μL dNTP MIX、2 μL DTT和1 μL AMV）進行反轉錄。采用Sybrpremix ex Taq試劑盒（Takara）擴增，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環，72 ℃再延伸5 min。定量RT-PCR中使用特異性基因表達引物見表1。數據分析采用2-ΔΔCt法進行相對量化。以mGAPDH為內參基因。

1.6? Western blot檢測

取小鼠主動脈，試劑盒提取蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后恒定電流200 mA轉至PVDF膜。室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應的一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜，洗滌后換HRP標記二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。洗滌后采用化學發光試劑盒在GE mageQuant LAS 4000 mini超靈敏化學發光成像儀顯影，Gel Image ststem ver.4.00對圖像進行灰度分析。

1.7? 亞硫酸氫鹽測序法檢測

選擇Atg13啟動子中富含CpG的區域測序。1 μg基因組DNA使用DNA甲基化試劑盒轉化的亞硫酸氫鹽。上游引物5'-TTTGAAGATTTTGATGTATAGA AATATT-3'，下游引物5'-ATTATTACCCTCAAAAATA AATACCT-3'，擴增產物長度均為448 bp;使用MethPrimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi）設計。用SK8141-PCR對PCR產物進行純化，克隆到pUC18-T載體系統中，轉化為SK9307細胞。選擇獨立的白色菌落，并使用Genomelabgexp基因分析系統測序。采用亞硫酸氫鹽測序DNA甲基化分析軟件對測序數據進行分析。對各實驗組中每個CpG位點的平均甲基化百分比進行分析。

1.8? 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件進行分析。計量資料用—x±s表示，組間比較方差齊時用方差分析，兩兩比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 丹紅注射液對模型小鼠主動脈自噬標志性基因LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組小鼠主動脈Beclin1蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），丹紅低劑量組小鼠主動脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），丹紅高劑量組小鼠主動脈LC3Ⅱ/Ⅰ表達差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖1。

2.2? 丹紅注射液對模型小鼠主動脈自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組主動脈小鼠自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖2。

2.3? 丹紅注射液對模型小鼠主動脈自噬基因Atg13啟動子區甲基化水平的影響

與模型組比較，丹紅高、低劑量組小鼠主動脈自噬基因Atg13啟動子區甲基化水平明顯降低（P<0.01）。結果見圖3。

2.4? 丹紅注射液對模型小鼠主動脈PI3K/Akt/mTORC1信號通路的影響

與模型組比較，丹紅低、高劑量組小鼠主動脈p-Akt蛋白表達明顯降低，丹紅高劑量組小鼠主動脈p-mTORC1蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見圖4。

3? 討論

AS是心腦血管疾病發病的共同病理基礎，血脈瘀阻是心腦血管疾病的共同中醫病機。活血化瘀中藥丹紅注射液治療AS體現了中醫“腦心同治”理論，見心病而兼治腦，見腦病同時兼顧心，符合中醫整體觀念異病同治思想，臨床上廣泛用于AS性心腦血管疾病的治療[6]。最新研究發現，細胞異常自噬和基因的DNA甲基化修飾異常是AS發生的重要機制[7]。

自噬是細胞在自噬基因的調控下，利用溶酶體降解細胞內受損細胞器及大分子物質的過程。在AS病變早期，通過自噬降解細胞內受損結構，以適應炎癥、缺氧等環境改變，延緩AS發展[8]。Beclin1是細胞自噬的關鍵調控因子，是自噬體形成必需分子，可介導自噬相關蛋白定位于吞噬泡，調控自噬體形成[9]。此外，微管相關蛋白前體LC3被裂解，產生一種活躍的細胞溶質形式（LC3-Ⅰ），然后被催化和結合成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的相對量可反映自噬體的量，這種LC3亞型是目前最廣泛用來檢測自噬體的分子標記[10]。呂燕妮等[11]應用系統生物學方法模擬分析丹紅注射液中丹參與紅花配伍的分子機制，其機制可能主要在細胞自噬、脂質代謝等生物學途徑上協同發揮防治疾病的作用。本實驗結果表明，丹紅注射液可明顯促進AS小鼠主動脈Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達，以及自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表達。提示促進細胞自噬可能是丹紅注射液抑制AS的重要機制之一。研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路是AS形成的重要信號傳導通路，該通路激活在自噬中發揮關鍵的調節作用，mTOR活化后主要調控自噬基因Atg13表達[12]。我們研究結果提示，丹紅注射液可能通過抑制Akt在Ser473位點的磷酸化和mTORC1在Ser2448位點的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，從而促進自噬基因Atg13的表達，促進自噬，發揮抗AS作用。

既往活血化瘀抗AS作用機制研究主要集中在調脂、抗炎、保護細胞內皮、降低血液黏稠度等方面，近年來，隨著基因組學和表觀遺傳研究在心血管研究領域的發展和深入，從DNA甲基化修飾為代表的表觀遺傳學角度來探討活血化瘀中藥的藥理機制，為研究活血中藥機制研究提供了新的思路與方法[13]。隨著DNA甲基化修飾與AS之間相關性的揭示，逆轉基因的異常甲基化成為治療AS的理想靶點。我們課題組既往研究表明，丹紅注射液可明顯降低AS小鼠血脂水平，減少AS斑塊面積，發揮抗AS作用，其機制可能與降低AS小鼠血清基因組甲基化水平、抑制AS小鼠血清學和主動脈斑塊DNMT1表達有關[1]。提示丹紅注射液可明顯抑制AS，其機制與DNA甲基化調控有關。另有研究表明，DNMT1基因沉默后可明顯改善由振動剪切刺激導致的血管內皮功能紊亂，其機制與抑制PI3K/Akt/mTORC1信號通路的活化和誘導自噬有關[14]，提示抑制DNMT1參與調控細胞自噬，發揮抗AS作用。上述提示丹紅注射液抗AS的機制可能與調控自噬及相關通路有關。由于Atg13是自噬發生的關鍵基因，并受PI3K/Akt/mTOR信號通路調控，所以，本研究靶向Atg13的DNA甲基化修飾，探究丹紅注射液調控DNA甲基化干預AS的具體機制和干預環節。結果表明，丹紅注射液通過降低AS小鼠主動脈Atg13啟動子區甲基化水平，促進Atg13基因表達及自噬，防治AS的機制這一過程中還可能與抑制PI3K/Akt/ mTORC1信號通路活化有關。

綜上所述，丹紅注射液防治AS的機制可能與降低AS小鼠主動脈Atg13啟動子區甲基化水平，抑制PI3K/Akt/mTORC1信號通路，促進細胞自噬有關。具體機制尚需今后深入研究。

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（收稿日期：2019-03-19）

（修回日期：2019-04-11;編輯：華強）