結核感染T淋巴細胞實驗和Xpert MTB/RIF檢測在糖尿病并發菌陰性肺結核患者診斷中的價值*

周 祎,張 寧,劉曉榮,劉 莉

陜西省結核病防治院內五科(西安 710100)

結核病仍是威脅人類健康的主要公共衛生和社會問題[1]。糖尿病患者是目前臨床常見病及多發病，也是結核病的危險因素之一[2]。另外糖尿病病理過程也會影響抗結核藥物的治療效果及結核病的預后[3-4]。因此早診斷、早治療對結核病并發糖尿病的預后尤為重要。目前肺結核的診斷主要依賴于臨床癥狀、胸部X線特征和痰細菌學檢查等，細菌學檢測為結核診斷提供了確切依據，但痰菌檢測易受多種因素影響，據報道約60%的肺結核患者痰涂片表現為抗酸桿菌陰性，從而對部分患者造成漏診或誤診[5]。結核感染T淋巴細胞實驗(T-SPOT.TB)是一種新型的免疫酶技術，能夠在細胞水平進行結核桿菌的檢測。Gen-XpertMTB/RIF試驗是WHO推薦用于檢測結核病的分子診斷平臺，是以半巢式實時熒光PCR技術為基礎，可在2.5 h內檢出TB和利福平的耐藥性，且該方法操作簡便，對實驗環境要求不高，明顯縮短了所有可疑結核患者檢測時間。但是目前T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測對糖尿病并發菌陰性肺結核患者診斷中的應用價值尚不明確。本研究通過對糖尿病并發菌陽性和菌陰性肺結核患者血液和痰液標本進行結核抗體(TB-AB)，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測，比較和評價T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF檢測對糖尿病并發菌陰性肺結核患者的診斷價值。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年7月至2017年8月陜西省結核病防治院收治的糖尿病并發肺結核患者共285例，其中菌陽肺結核并發糖尿病患者111(42.20%)例，均通過細菌學和臨床診斷確診；菌陰性肺結核并發糖尿病患者152 (57.80%)例，均通過臨床和輔助診斷確診。排除病例22例，其中肺炎12例，非結核分枝桿菌肺病4例，肺部腫瘤6例。263例患者同時行結核抗體、T-SPOT檢測和Gen-XpertMTB/RIF 檢測,其中男217例，女46例；年齡15～83歲，平均年齡(53.60±13.44)歲。根據診斷結果：①菌陽組肺結核并發糖尿病患者 111例，男91例，女20例 ；年齡16～80歲，平均年齡(53.58±13.22)歲；②菌陰組肺結核并發糖尿病152 例，男126例，女26例；年齡15～83歲，平均年齡(53.62±13.65)歲。肺結核診斷符合國家衛計委發布的《新版肺結核的分類及診斷標準(2018年版)》[6]。糖尿病診斷符合2012年美國糖尿病學會(ADA)糖尿病診療指南中的糖尿病診斷標準[7]。

2 檢測方法

2.1 血清結核抗體(TB-AB)檢測：采集住院患者的晨起靜脈血4 ml于帶凝膠的紅帽血清管中，標本按常規法分離、儲存。嚴格按照MTB IgG和IgM抗體檢測試劑盒(蛋白抗體)使用說明書(南京大淵生物技術工程有限責任公司)進行操作，采用蛋白芯片法分別檢測菌陽組和菌陰組肺結核并發糖尿病患者血清16kD和38kD及LAM蛋白抗體；采用膠體金法檢測血清MTB-IgG和MTB-IgM抗體。結果按說明書判斷：上述5種任一抗體結果陽性即判為檢測陽性，血清5種抗體全部陰性判為檢測陰性。蛋白芯片法和膠體金法檢測肺結核患者血清抗結核抗體操作簡便，不需要特殊儀器，耗時少，前者約10～30 min，后者約10 min內完成。

2.2 T-SPOT.TB檢測：用肝素抗凝管抽取靜脈血4～6 ml，無需空腹，輕柔顛倒混勻5-10次，避免溶血及凝結；做好患者標識，直立放置于室溫(15～25℃)，不得冷凍和冷藏。實驗操作嚴格按照T-SPOT.TB試劑盒(美國Oxford immuno-tec公司)說明書進行。首先進行外周血單個核細胞分離制備，其次對單個核細胞進行洗滌和計數，然后制備工作濃度細胞懸液，再將細胞懸液和抗原加入微孔培養板，置于37℃，于5% CO2培養箱中孵育過夜，洗滌微孔板并加入酶標抗體，再洗滌微孔板，加入底物反應液，最后進行斑點計數。根據抗原A和(或)抗原B孔的反應判斷結果：陰性對照孔斑點數為0-5，陽性樣本應為：抗原A或抗原B斑點數-陰性對照孔斑點數≥6；當對照孔斑點數≥6，陽性樣本應為：抗原A或抗原B斑點數≥2×陰性對照孔斑點數。

2.3 Gen-XpertMTB/RIF檢測:收集肺結核并發糖尿病患者的即時痰液標本于痰瓶中，擰緊瓶蓋，痰樣本保存于2～8℃，及時送檢。Gen-XpertMTB/RIF檢測系統及試劑盒由美國Cepheid公司生產。按照儀器、試劑操作要求對標本進行處理后，取2 ml加入反應盒，將反應盒放入檢測模塊儀器進行檢測，反應結束后，在檢測系統窗口下直接觀察測試結果，系統報告為錯誤、無效的結果不納入結果統計中。

3 觀察指標 ①以肺結核臨床診斷為金標準，比較TB-AB、T-SPOT.TB檢測和Gen-Xpert MTB/RIF檢測3種方法檢測糖尿病并發肺結核的陽性率之間的差異；②比較TB-AB、T-SPOT.TB檢測和Gen-Xpert MTB/RIF檢測3種方法在菌陽組、菌陰組之間的差異；③比較菌陰組不同性別和年齡段患者三種方法檢出陽性率的差異；④檢測各種檢測方法聯合應用診斷陽性率的變化。

4 統計學方法 使用SPSS 22.0統計學軟件進行統計學處理，TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF檢測陽性率之間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 三種檢測方法在肺結核并發糖尿病患者中陽性率的比較 263例臨床診斷為糖尿病并發肺結核患者中TB-AB檢出陽性163例，陽性率為61.98%；T-SPOT.TB檢出陽性222例，陽性率為84.41%；Gen-XpertMTB/RIF檢出陽性188例，陽性率為71.48%。三種檢測方法之間的陽性率相比，差異具有統計學意義(χ2=33.544，P=0.000)。T-SPOT.TB陽性率與TB-AB陽性率比較差異有統計學意義(χ2=33.730，P=0.000)；Gen-XpertMTB/RIF檢出陽性率與TB-AB檢測陽性率比較差異有統計學意義(χ2=5.325，P=0.021)；T-SPOT.TB陽性率與Gen-XpertMTB/RIF陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=12.785，P=0.000)

2 三種檢測方法在糖尿病并發肺結核菌陽組、菌陰組患者陽性率的比較 111例糖尿病并發菌陽肺結核患者中，TB-AB陽性率為64.86%(72/11)；T-SPOT.TB檢出陽性率為89.19%(99/111)；Gen-XpertMTB/RIF陽性率為77.47%(86/111)。152例糖尿病并發菌陰肺結核患者中，TB-AB陽性率為59.87%(72/152)，T- SPOT.TB陽性率為80.92%(123/152)，Gen-XpertMTB/RIF陽性率為67.11%(102/152)。卡方檢驗顯示：菌陽組和菌陰組之間三種方法檢測陽性率比較差異均無統計學意義(P=0.068，P=0.410和P=0.066)。

3 不同年齡和性別糖尿病并發菌陰肺結核患者中三種檢測方法陽性率的差異 我們比較了三種結核檢測方法對不同年齡和性別糖尿病并發菌陰肺結核患者中陽性率的差異，結果如表1所示：三種方法在男性患者和女性患者中的檢出陽性率相當，比較差異均無統計學意義。此外，根據年齡分層后，在不同年齡患者三種檢測方法的陽性率比較差異無統計學意義，而在相同年齡段的患者中，T-SPOT.TB陽性率較高，Gen-XpertMTB/RIF次之，結核抗體陽性率較低。

表1不同年齡和性別糖尿病并發菌陰肺結核患者中三種檢測陽性率的比較[例(%)]

4 結核抗體、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF聯合應用檢出陽性率比較 我們進一步分析了三種方法聯合應用對結核檢出陽性率的影響，結果如表2所示：2種方法或3種方法聯合使用，檢出率均有所提高。T-SPOT.TB與結核抗體或Gen-XpertMTB/RIF聯用，菌陰組TB陽性率均達到90%以上，而三種聯用時菌陰組檢測陽性率則達到94.73%。三種方法單獨使用或聯合應用，其陽性率在菌陰組和菌陽組之間均無統計學差異。

表2TB-AB、T-SPOT.TB和Gen-Xpert MTB/RIF聯合診斷陽性率比較[例(%)]

討 論

2017年WHO全球結核病報告指出，2016年全球新發結核病1040萬例，中國新發結核病患者89.5萬例，因此，結核病仍是威脅人類健康的主要公共衛生和社會問題[1]。2015年全球糖尿病患病率達到8.8%，即估計全球共有4.15億糖尿病患者，其中75%來自低收入國家.中國是世界上糖尿病患者最多的國家，糖尿病患者是結核病的高危人群。據報道，我國肺結核患者中有超過10%患有糖尿病，糖尿病人新發肺結核是正常人的3倍[8]。糖尿病患者血糖持續高水平可引起機體代謝紊亂，導致免疫力低下，且高血糖為結核菌繁殖提供良好培養基，從而增加易感性；血糖過高可造成機體內環境呈酸性，有利于結核菌的生長及繁殖；另外糖尿病可累及肺部，導致微血管病變和氣道黏膜受損，有利于結核菌的繁殖。另外，與單純TB患者相比，合并糖尿病患者表現出更高的分枝桿菌載量、肺部空洞比例、更高的耐藥性以及更高的復發率和病死率。因此，糖尿病患者的不斷增加對全球結核病的控制造成威脅。早發現、早診斷、早治療糖尿病并發肺結核患者，對控制兩病共流行的疫情意義重大。但目前結核病病原學診斷率低，2017年全球結核病報告指出，我國登記的肺結核患者中，細菌學陽性率僅為31%[9]，難以滿足臨床診斷的需求，結核分枝桿菌培養雖是結核病診斷的金標準，但其生長緩慢耗時，不適合結核病的早期診斷[10]。結核病血清免疫診斷的臨床應用研究逐漸成為全球結核領域的熱點，在臨床廣泛應用，但存在假陽性及假陰性的問題，從而影響著臨床診斷[10]。

近年的研究發現，結核分枝桿菌RD1區編碼一些結核分枝桿菌特異性復合抗原，如ESAT-6和CFP-10，它們是重要的T淋巴細胞抗原，可以被結核桿菌感染的免疫活性T淋巴細胞識別，產生高水平的IFN-γ[11]。T-SPOT.TB是由酶聯免疫斑點技術發展而來，通過以ESAT-6和CFP-10刺激外周血單核細胞中的結核特異性T細胞分泌IFN-γ與否來判定是否感染結核，其敏感性和特異性可達到83%～97%[12-13]。但它不能鑒別活動性結核病和潛伏感染而不推薦用于活動性結核病的診斷[14-15]。楊宜英等[16]報道，T-SPOT.TB在菌陽和菌陰結核中的陽性率分別為95.5%和85.9%。劉佳慶等[17]的研究中，T-SPOT.TB在菌陰結核中的陽性率為83.7%。本研究中糖尿病并發菌陰肺結核患者中T-SPOT.TB陽性率為80.92%，與前述研究結果接近，表明T-SPOT.TB在糖尿病患者中也具有臨床應用價值。

Gen-XpertMTB/RIF試驗是WHO推薦用于檢測結核病的分子診斷平臺，是以半巢式實時熒光PCR技術為基礎，rpoB基因利福平耐藥決定區(RRDR)的81bp核心區為靶序列，可在2.5 h內檢出MTB和利福平的耐藥性，且該方法操作簡便，對實驗環境要求不高，明顯縮短了可疑結核患者檢測所需時間[18-20]。部分研究表明，隨著分子生物學技術進入結核病領域，先進的分子生物學檢測技術可以明顯提高病原學陽性率。但其成本高，不適合在基層單位廣泛開展。Gen-XpertMTB/RIF近年發展迅速，與傳統檢測方法比較，敏感度和特異度均明顯升高[21-22]。目前，關于Gene-Xpert MTB/RIF在菌陰性肺結核中的檢測陽性率的報道也存在較大差異。陳子芳等[23]作者的研究顯示：126例菌陰性結核患者中 Gene-Xpert MTB/RIF痰檢陽性患者49例，陽性率僅為38.89%，而支氣管肺泡灌洗液檢測陽性率為53.17%。蔡向敬等[24]最近的報道中，317例菌陰性結核患者Gene-Xpert MTB/RIF法的檢出率為61.40%。本文中Gene-Xpert MTB/RIF的檢出率為67.11%，與后者較接近。我們也發現在菌陰組Gene-Xpert MTB/RIF的檢出率顯著低于T-SPOT.TB，這可能是由于菌陰組患者痰液樣本中的菌含量較低，甚至可能低于Gene-Xpert MTB/RIF的檢出限，使其陽性率低于T-SPOT.TB對血液樣本中的檢出率。此外，Gene-Xpert MTB/RIF與T-SPOT.TB聯用后，菌陰性結核的陽性率達到92%，檢出率較大幅度升高，更有助于快速診斷。

綜上，在糖尿病并發菌陰肺結核患者中，T-SPOT.TB和Gen-XpertMTB/RIF方法診斷效率高于傳統的結核抗體檢測，從而有助于糖尿病并發菌陰肺結核的快速診斷，但是其診斷效能仍需更多的臨床樣本予以證實。