膀胱穿刺活檢術(shù)在膀胱出口部分梗阻大鼠中應(yīng)用的可行性

劉 迅，陳 林，何平林，王 凱，劉俊瑩，陳書練，楊 進(jìn)，羅 旭

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義 563000；2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610081；3.成都大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610081)

穿刺活檢術(shù)是臨床上診斷腫瘤或某些癌前病變最重要、最準(zhǔn)確的方法之一，是國際公認(rèn)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但膀胱腫瘤的診斷目前臨床仍采取傳統(tǒng)的影像學(xué)或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethral bladder tumor resection，TUR-BT)等方法。然而影像學(xué)檢查并非完全可靠，只能作為初步篩查方法。TUR-BT既為重要診斷方法，也為主要治療手段，但腫瘤的病理分級(jí)及分期都需要借助首次TUR-BT后的病理檢查獲得，大部分患者往往需要進(jìn)行二次手術(shù)，增加腫瘤分期提前以及殘留癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]，且該方法創(chuàng)傷較大,有時(shí)取不到膀胱肌層，無法準(zhǔn)確判斷腫瘤分期，影響進(jìn)一步治療決策。另一方面，在探究膀胱功能障礙的病理生理過程中，動(dòng)物模型的使用是必不可少的[2]。傳統(tǒng)取膀胱活檢的方法主要是通過解剖刀在膀胱壁的一側(cè)切下一塊組織，然后再將膀胱對合逐層縫合[3]。該操作不僅過程繁瑣，且創(chuàng)傷性較大，所需愈合時(shí)間長，不利于對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的進(jìn)一步操作。如若可將膀胱穿刺術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，即可避免手術(shù)操作給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來較大創(chuàng)傷，又可得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這將為膀胱研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供新型的膀胱組織提取方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，雙孔鉀離子通道(TWIK related K+channel 1，TERK-1)是正常人膀胱逼尿肌中調(diào)節(jié)機(jī)械牽拉刺激的主要離子通道之一，其為雙孔結(jié)構(gòu)的機(jī)械門控鉀通道(two-pore-domain mechano-gated potassium channel，K2P)亞家族中的主要表達(dá)成員[4]。且研究已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)膀胱逼尿肌進(jìn)行性充盈時(shí)TERK-1具有穩(wěn)定膜電位的作用，從而降低膀胱興奮性和防止發(fā)生收縮排尿[5]。先前有學(xué)者觀察到，TERK-1在膀胱出口梗阻小鼠的逼尿肌中表達(dá)下調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將膀胱穿刺活檢術(shù)應(yīng)用于膀胱出口部分梗阻大鼠，通過觀察不同梗阻時(shí)間膀胱逼尿肌的形態(tài)學(xué)變化及膀胱組織中TERK-1通道的表達(dá)情況，評價(jià)并討論膀胱穿刺活檢術(shù)在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物該實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將18只Sprague-Dawley雌性大鼠(體重250～280 g，8～12周齡，中國成都，達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分為對照組(n=6)、梗阻14 d組(n=6)和梗阻28 d組(n=6)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，保持在光控(12 h光照/黑暗循環(huán))籠中，每個(gè)籠子有3只大鼠，可自由攝取食物和水。

1.2 建立膀胱出口部分梗阻模型本實(shí)驗(yàn)采用CHEN等[7]的新型膀胱出口部分梗阻模型建立方法,即尿道外口梗阻法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)大鼠模型的建立，為保證動(dòng)物模型的一致性，所有手術(shù)均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生操作。具體操作為，吸入異氟烷麻醉大鼠,消毒下腹部及尿道外口，將小兒靜脈留置導(dǎo)管(G 26，內(nèi)徑=0.4 mm，外徑=0.6 mm，16 mm)經(jīng)尿道插入大鼠膀胱，將不可吸收的6-0帶線縫合針(杭州艾普醫(yī)療器械有限公司，杭州，中國)在12點(diǎn)鐘位置縱向穿過尿道口，在尿道口的6點(diǎn)鐘方向穿出并打結(jié)。縫線結(jié)形成后移除導(dǎo)管，以產(chǎn)生下尿路梗阻癥狀。

1.3 膀胱穿刺常規(guī)麻醉、消毒后，取下腹部正中切口，長約1.5～2 cm，逐層切開皮膚及皮下組織，鈍性分離腹壁肌肉，打開腹膜，將充盈膀胱輕輕提起，采用臨床上使用的全自動(dòng)型活檢針(G 18，長150 mm，針突長22 mm)垂直穿過膀胱前后壁，激發(fā)活檢槍后抽出。取標(biāo)本時(shí)應(yīng)盡量取到膀胱壁全層，將標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛溶液質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)中固定。固定1 d后用石蠟包埋，將包埋好的組織切成薄切片(5 mm)，舒展開置于載玻片上，放入45 ℃的恒溫箱中烘干。

1.4 HE染色將切片置于二甲苯中脫蠟后，依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、75%、85%乙醇(體積分?jǐn)?shù))中水化，蘇木素染色5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗，入伊紅染液中染色5 min。由低到高逐級(jí)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)流程操作，將石蠟切片脫蠟水化，步驟同1.4，將切片浸在檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中，置于微波爐內(nèi)煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，滴加3%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育25 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗。將配好的5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白溶液(albumin from bovine serum，BSA)覆蓋組織，封閉30 min后，滴加1∶100的一抗(K2P2.1，Alomone labs APC-O47)，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS溶液沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育50 min，再次PBS溶液沖洗3次，滴加現(xiàn)配制的DAB顯色液(Dako REALTM EnVisionTM Detection System,Peroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse)，顯微鏡下觀察染色程度把握終止顯色時(shí)間。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸乙醇(體積分?jǐn)?shù))分化，流水沖洗，由低到高逐級(jí)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。將封好的玻片放在200倍光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為TERK-1通道蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞，我們根據(jù)著色強(qiáng)度通過圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0)對TERK-1通道表達(dá)情況進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，定義P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色200倍光學(xué)顯微鏡下可觀察到對照組大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞體積適中、排列緊湊、肌纖維分布均勻，但在標(biāo)本中未能觀察到膀胱上皮結(jié)構(gòu)；與對照組相比，14 d梗阻組和28 d梗阻組的大鼠膀胱肌纖維束排列紊亂、形態(tài)不規(guī)則，肌間隙明顯增寬，肌細(xì)胞肥大，膀胱平滑肌橫截面明顯增厚(圖1A～C)。

2.2 大鼠膀胱壁中TERK-1通道分布及表達(dá)情況結(jié)果表明，SD大鼠膀胱中TERK-1通道的表達(dá)隨著梗阻時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢，梗阻28 d的大鼠比對照組大鼠表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.122，P=0.035，圖1D～G)。

圖1 采用膀胱穿刺活檢技術(shù)獲得的正常和梗阻膀胱組織觀察

A：對照組(HE，×200)；B：梗阻14 d組(HE，×200)；C：梗阻28 d組(HE，×200)；D：對照組(TERK-1，×200)；E：梗阻14 d組(TERK-1，×200)；F：梗阻28 d組(TERK-1，×200)；圖B、C中箭頭所指為膀胱平滑肌病理性肥厚擴(kuò)張；圖D、E、F中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為TERK-1通道蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞；G：免疫組化TERK-1蛋白陽性表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。

3 討 論

膀胱的急性充盈期同時(shí)受到神經(jīng)源性和肌源性的共同調(diào)節(jié)，該機(jī)制可降低膀胱內(nèi)壓力以適應(yīng)進(jìn)行性尿量增加導(dǎo)致的膀胱容積的急劇擴(kuò)增。在長期的膀胱出口梗阻中，持續(xù)的膀胱高壓可引起膀胱壁的慢性缺血缺氧和去神經(jīng)化作用，從而導(dǎo)致膀胱功能障礙[8-10]。但急性的膀胱出口梗阻由于傳入膀胱神經(jīng)沖動(dòng)的增加，可導(dǎo)致膀胱逼尿肌的過度活動(dòng)，是導(dǎo)致膀胱平滑肌的代償性肥大的機(jī)制之一[11]。已經(jīng)證明，在膀胱出口梗阻4周時(shí)，即可出現(xiàn)膀胱逼尿肌的明顯增厚與肥大[12]，該結(jié)論與本研究結(jié)果一致(圖1C)。

此外，肌源性學(xué)說在調(diào)節(jié)膀胱興奮性的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[13]。目前，研究者已經(jīng)證實(shí)了幾種類型的機(jī)械敏感K+通道的作用[14]。為了進(jìn)一步證實(shí)穿刺標(biāo)本的可應(yīng)用性，我們選擇了目前研究相對成熟的TERK-1機(jī)械門控鉀離子通道，該通道蛋白廣泛分布于膀胱尿路上皮和平滑肌層組織中，陽性表達(dá)率高，便于觀察染色結(jié)果[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱平滑肌充盈、拉伸過程中，TERK-1發(fā)揮了穩(wěn)定逼尿肌膜電位的重要作用，其表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致膀胱逼尿肌過度活動(dòng)的一個(gè)重要因素。通過對穿刺膀胱標(biāo)本進(jìn)行TERK-1抗體的免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)該通道蛋白隨著梗阻時(shí)間的延長呈明顯下降趨勢(圖1D～G)，與已知結(jié)論相吻合，進(jìn)一步證明了穿刺組織標(biāo)本的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究中，我們針對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膀胱穿刺活檢技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了探討，證明利用穿刺針取出的膀胱組織標(biāo)本足以用于HE染色及免疫組化等病理學(xué)分析研究。經(jīng)化學(xué)染色后，在光鏡下可清楚觀察到膀胱肌層形態(tài)及排列方式，與傳統(tǒng)方法取出的組織標(biāo)本相比，鏡下形態(tài)差異并不顯著。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解到，這是首次將膀胱穿刺活檢技術(shù)應(yīng)用于大鼠，不僅以微創(chuàng)的方法成功提取了膀胱組織，保留了膀胱結(jié)構(gòu)的完整性，降低了腹腔感染及膀胱與腹壁粘連的幾率，更重要的是該標(biāo)本可清楚觀察到梗阻大鼠膀胱逼尿肌的形態(tài)學(xué)變化，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但該方法也存在一定的局限性，從HE染色標(biāo)本中，我們未能觀察到膀胱內(nèi)整齊排列的移行上皮細(xì)胞，可能是由于穿刺過程中穿刺針破壞了上皮結(jié)構(gòu)。其次，由于穿刺的組織體積較小，可提取的蛋白量可能較少，因此，不適宜利用蛋白印跡法對目標(biāo)蛋白進(jìn)行半定量分析。

所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是為臨床應(yīng)用做準(zhǔn)備，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，國內(nèi)外已有學(xué)者探索了臨床上影像學(xué)輔助下的膀胱穿刺活檢技術(shù)對于肌層浸潤性膀胱癌病理診斷的實(shí)際意義。早在1991年，HOSHI等[16]日本學(xué)者報(bào)道了關(guān)于超聲引導(dǎo)下的經(jīng)皮膀胱全層穿刺活檢技術(shù)，初步探索了肌層浸潤性膀胱癌患者在放療或化療等新輔助治療過程中對腫瘤分期的判斷及治療效果的評價(jià)。隨后，MALMSTROM等[17]進(jìn)一步探究了經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(computer tomography，CT)引導(dǎo)的經(jīng)皮膀胱穿刺活檢技術(shù)，再次證實(shí)穿刺技術(shù)可以收集足夠的有價(jià)值的病理學(xué)材料。近幾年，國內(nèi)也有學(xué)者證實(shí)了超聲引導(dǎo)下的膀胱穿刺活檢技術(shù)對腫瘤性質(zhì)的鑒別是一種行之有效的方法[18]。雖然穿刺活檢技術(shù)與傳統(tǒng)的TUR-BT相比，具有安全、高效、操作簡單、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，但CHLOSTA等[19]也提出應(yīng)用該方法判斷膀胱原位癌或淺表性腫瘤具有一定的缺陷。由于相關(guān)臨床研究較少，關(guān)于膀胱穿刺是否會(huì)導(dǎo)致腫瘤的種植轉(zhuǎn)移，目前還沒有明確定論，但有學(xué)者認(rèn)為，因穿刺而導(dǎo)致的播散幾率不應(yīng)大于大范圍的TUR-BT[20]。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)并發(fā)癥，但畢竟臨床樣本量有限，對于該方法是否可以完全取代TUR-BT，還需進(jìn)一步的探究。

綜上所述，膀胱穿刺術(shù)以微創(chuàng)的方法成功收集了組織標(biāo)本用于形態(tài)學(xué)及病理學(xué)檢測，可保留膀胱結(jié)構(gòu)完整，降低腹腔感染及膀胱與腹壁粘連的幾率，使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有可能重復(fù)利用，是可行的操作方法。