基于T淋巴細胞的腫瘤免疫綜合治療

儲以微

腫瘤治療是全球性難題，近年來我國惡性腫瘤的發病率和死亡率持續升高，因傳統治療的療效有限，亟待創新思路、開拓發展。免疫系統是機體抵御腫瘤的重要防線，也是維持自身穩態的關鍵，從免疫角度探尋腫瘤治療新手段行之有效。腫瘤免疫治療遵循免疫識別、免疫活化和免疫效應3個基本過程，T淋巴細胞是這一過程中的主要實施者，且有正性和負性兩群T淋巴細胞同時存在于免疫系統，負性T淋巴細胞誘導免疫耐受致腫瘤發生，而正性T淋巴細胞激活免疫應答以清除腫瘤。為重塑免疫微環境，提升免疫治療效果，在國家自然科學基金基礎研究項目和上海市科學技術委員會應用研究項目的持續資助下，依托復旦大學生物治療研究中心，圍繞如何抑制負向免疫調控的負性T淋巴細胞——調節性T淋巴細胞(Treg)，增強實施免疫攻擊的正性T淋巴細胞——效應性T淋巴細胞(Teff)，本項目研究組(圖1)開展了系列臨床前和臨床研究，獲得的主要學術成績如下。

圖1 腫瘤免疫治療項目研究組成員

1 采用低劑量放射和化學治療(簡稱放化療)選擇性抑制負性T淋巴細胞增殖和功能

圍繞如何抑制負性T淋巴細胞功能，本項目研究組于2006年首次證實低劑量抗腫瘤放化療致淋巴細胞減少，為重塑免疫微環境提供空間，促進Teff借“淋巴細胞自穩增生”機制發生活躍增殖，并獲得記憶樣表型。同時，選擇性誘導Treg凋亡、打破腫瘤免疫耐受、逆轉免疫抑制性微環境。主要表現如下：①經化學治療(簡稱化療)藥物處理后，小鼠外周血、脾臟和淋巴結呈現典型的淋巴細胞減少和后續的活化增殖現象，淋巴細胞總數于化療后第4天左右跌至最低點，并在之后1周左右恢復至正常水平；②低劑量全身放射線照射小鼠，同樣能夠引發小鼠淋巴細胞減少現象，即實驗小鼠外周血、淋巴結和脾臟淋巴細胞數量在放射線照射后第4天左右跌至最低點，之后逐漸恢復；③較之其他T淋巴細胞亞群，CD4+CD25+叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Fox)p3+Treg對放化療的殺傷作用更為敏感；④化療藥物紫杉醇注射液(商品名為泰素)能夠通過上調CD95的表達誘導Treg凋亡，并通過下調Foxp3表達阻斷Treg的抑制功能；⑤化療藥物紫杉醇注射液還能降低CD122+CD8+記憶性T淋巴細胞亞群在T淋巴細胞中的比例；⑥化療藥物紫杉醇注射液對T淋巴細胞的增殖沒有影響，但可以促進活化T淋巴細胞的存活；⑦放射線照射后第14和21天，小鼠淋巴結中具有記憶表型(CD44high和CD62Llow)的T淋巴細胞比例明顯上調。因此，該研究顛覆化療損害免疫系統的傳統觀點，為放化療聯合免疫治療提供最佳“時間窗”的序貫方案。相關文獻發表于臨床免疫學、免疫治療等專業期刊ClincalImmunology、JournalofImmunotherapy，單篇最高引用達74次，引用雜志包括NatureCommunications、Neuro-Oncology、CancerResearch、CellDeathandDifferentiation等權威期刊。相關內容還獲邀在國際免疫學大會(2007年)、全國腫瘤生物治療大會(2010年)和全國免疫學大會(2008年)上作口頭報告。

2 自主研發快速樹突狀細胞培養技術并開展臨床研究

圍繞如何增強正性T淋巴細胞腫瘤識別，聚焦樹突狀細胞這一免疫系統抗原提呈功能最強的細胞，自主研發了快速樹突狀細胞培養法(FastDC)，有效將傳統的7～9 d的培養時間縮短為3 d，已獲國家發明專利授權(專利號為ZL201310610764.8)，并成功實現成果轉讓(2016070601324800)。同時，利用CD133或A2B5篩選腫瘤干細胞，并制備相應的腫瘤抗原負載樹突狀細胞，在小鼠荷瘤模型中獲得顯著療效。同時，通過分離患者外周血單核細胞體外誘導不成熟的樹突狀細胞，利用該患者腫瘤干細胞裂解液誘導成熟的樹突狀細胞疫苗，回輸至患者體內，實現個體化治療。相關Ⅰ期臨床研究共入組5例復發腦膠質瘤患者，予以樹突狀細胞疫苗皮下注射(每周1次，共3次)，臨床觀察患者無明顯不良反應，中位生存期達17.5個月，提示該疫苗患者的耐受性好，安全性高(結果發表于2011年的《中華神經外科雜志》)。隨后，本項目研究組進一步開展了Ⅱ期臨床研究(NCT01567202，2011臨審第006號)以檢驗其有效性，歷時3年余(2012年12月1日—2016年1月20日)，入組43例新發或復發腦膠質瘤患者，同樣予以樹突狀細胞疫苗皮下注射(每周1次，共3次)。結果顯示，該樹突狀細胞疫苗將異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)基因野生型端粒逆轉錄酶(TERT)突變型(IDH1WTTERTMU)患者的無進展生存期延長了2.5個月(7比4.5個月)，總生存期延長了6.5個月(14比7.5個月)，同時伴隨輔助性T淋巴細胞(Th)1型細胞因子顯著增多，T淋巴細胞腫瘤局部的浸潤亦增多(結果發表于2018年CancerImmunology,Immunotherapy雜志)。

3 利用新型免疫佐劑Toll樣受體(TLRs)增強正性T淋巴細胞腫瘤殺傷能力

圍繞如何增強正性T淋巴細胞腫瘤識別和殺傷效應，聚焦TLRs。早期在果蠅研究中發現，TLRs主要在固有免疫系統中發揮作用，而近期在哺乳類動物的研究中發現TLRs同樣可以表達于適應性免疫細胞(如T、B淋巴細胞)表面，且其表達程度與特異性免疫應答強度密切相關。然而，TLRs直接作用在T淋巴細胞上發揮作用的機制，特別是在如腫瘤等病理條件下TLRs如何影響T淋巴細胞的活化、分化和免疫應答類型及其機制等尚待闡明。因此，本項目研究組基于小鼠荷瘤模型開展系列工作，證實了TLR1/2和TLR4激動劑的抗腫瘤效應及其機制。研究結果表明，全身給予TLR1/2或TLR4激動劑治療均可有效激發機體產生增強的抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤的發生、發展，延長荷瘤小鼠的生存時間，并能誘導長時程的免疫保護效應。在此基礎上，本項目研究組還對兩種激動劑的作用劑量、作用時間和作用方式進行了探索和優化，尋找最佳的抗腫瘤治療策略。TLR1/2激動劑抗腫瘤的作用機制是通過直接作用于適應性T淋巴細胞表面的TLR2受體，顯著下調Treg的免疫抑制功能，進而增強殺傷性T淋巴細胞(CTL)殺傷腫瘤的能力。而TLR4激動劑抗腫瘤的作用機制是通過TLR4受體直接促進CTL的殺傷功能，上調樹突狀細胞抗原提呈能力間接促進Teff的殺傷能力。首次證實了新型免疫佐劑TLRs通過多種機制增強正性T淋巴細胞的腫瘤殺傷能力，為其應用于臨床腫瘤治療提供依據，也為腫瘤免疫治療提供新策略。相關文章發表于免疫學專業期刊JournalofImmunology和ClinicalImmunology，單篇最高引用61次，引用期刊包括CancerImmunologyResearch、ClinicalCancerResearch、JournalofHepatology和Leukemia等權威期刊。鑒于該研究的新穎性和實用性，一經發表即被權威學術機構Faculty of 1000和Global Medical Discovery推薦。

4 自主研發針對實體瘤的新型雙特異性T淋巴細胞銜接子(BiTEs)淋巴細胞療法

圍繞如何增強正性T淋巴細胞腫瘤識別和殺傷功能，針對現有基于T淋巴細胞的免疫治療用于實體腫瘤療效欠佳的問題，自主研發了針對實體瘤的新型BiTEs淋巴細胞療法?；赥淋巴細胞的免疫療法主要包括嵌合抗原受體修飾T淋巴細胞(chimeric antigen receptor-T，CAR-T)治療和BiTEs淋巴細胞療法，兩種療法均已在非實體腫瘤中獲得顯著療效，并獲批上市，但其對實體腫瘤均未見顯著臨床療效。因此，本項目研究組針對實體腫瘤，創新性地制備了由BiTEs修飾T淋巴細胞的新型CAR-T樣細胞治療技術。該技術利用BiTEs修飾T淋巴細胞，使其可持續性產生并分泌BiTEs，克服了傳統BiTEs半衰期短、不可自我復制性、T淋巴細胞依賴，以及臨床應用需多次反復注射、成本高和毒副反應強等弊端。而分泌的BiTEs可同時作用于基因修飾T淋巴細胞和其他非基因修飾T淋巴細胞，使兩者均產生腫瘤特異性殺傷活性，分別發揮類似傳統CAR-T和傳統BiTEs的腫瘤特異性殺傷作用。此外，分泌的BiTEs還可直接作用于腫瘤細胞抑制其增殖，發揮類似抗體藥物的作用，可謂“一箭三雕”，高效殺傷腫瘤。已在小鼠體內證實了新型CAR-T樣細胞治療技術的安全性和顯著的抗腫瘤效果，相關內容獲邀在國際免疫學大會(2016年)、全國免疫學大會(2015、2017年)上作口頭報告。現該技術已獲國家發明專利授權(ZL201510158263.X)，并已通過臨床研究倫理審查(2015臨審第253號)。鑒于該研究的新穎性和原創性，一經發表即被多家媒體、公眾號報道和推送，并被多本專業期刊引用，如JournalofHematology&Oncology雜志評價該研究“為HER2陽性實體腫瘤治療提供了新策略”，這也充分說明了本項目研究組的工作具有重要意義。

綜上所述，本項目歷時12年(2006—2017年)，聚焦T淋巴細胞抗腫瘤效應，發現了2種免疫治療新機制，研發了2項免疫治療新技術，開展了3項基于T淋巴細胞治療的臨床研究，并提供了4種臨床有效的抗腫瘤免疫治療手段。本項目改變了傳統腫瘤治療理念，為提升臨床療效提供綜合性策略和方案。