糖尿病視網膜病變伴糖尿病腎病患者的血漿蛋白質組學研究

閻 利 劉 穎 張華北 陳建斌 李志琛 梅偉群 錢佳麗 歐陽建

糖尿病視網膜病變(DR)和糖尿病腎病(DN)是糖尿病的兩個主要微血管并發癥，嚴重影響患者的生活質量。糖尿病患者同時伴有DN的情況普遍，本研究應用Label-free蛋白質組定量技術，篩選DR伴DN患者血漿中差異表達蛋白，結合生物信息學分析，尋找DR、DN共病的機制和共同的干預靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究經解放軍第903醫院倫理委員會審查批準。選擇2型糖尿病患者14例，其中8例伴DR和DN(DNDR組)，6例不伴DN和DR(DM組)，兩組間患者的年齡、糖化血紅蛋白、病程的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準，血糖控制穩定。DNDR組納入標準：①依據2002年DR國際分期標準，雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR(NPDR)或增殖性DR(PDR)；②依據2012年美國糖尿病學會(ADA)篩查和診斷標準，測定即時尿白蛋白/肌酐(uACR)≥30 mg/g，3個月內3次ACR至少有2次升高。DM組納入標準：眼底照相除外DR，uACR<30 mg/g。排除標準：①高血壓病、冠狀動脈性心臟病(簡稱冠心病)、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤、腦卒中；②1型糖尿病(T1DM)、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿病；③嚴重角膜病變、白內障等影響眼底檢查；④葡萄膜炎、閉角型青光眼；⑤除DR外的其他視網膜疾病；⑥劇烈運動、發熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因導致ACR升高。查肌電圖、血糖、血脂、肝腎功能、纖維蛋白原、血壓、心電圖、心臟超聲、頸動脈和下肢血管超聲，兩組患者上述檢查結果的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。所有入選患者均了解研究方案并簽署知情同意書。

1.2 方法 由深圳華大基因公司對14例患者的血漿標本進行質檢和Label-free定量蛋白組學質譜檢測，每份標本檢測2次，總蛋白、肽段、譜圖數目均合格。

1.2.1 主要試劑和儀器 強陽離子交換柱(SCX)、Luna SCX購自美國Phenomenex公司；質譜儀(Triple TOF 5600)購自美國AB CSIEX公司。酶聯免疫吸附Human PDI ELISA Kit(LM-PDI-Hu)購自上海聯邁生物工程有限公司；KRT1 ELISA試劑盒(H-EL-KRT1)購自上海澤葉生物科技有限公司(ZYbscience)。

1.2.2 蛋白質提取和定量 取100 μg血漿，按蛋白質分離標準流程進行操作，考馬斯亮藍法(Bradford法)定量。

1.2.3 SD電泳 使用12% SDS-PAGE。14份血漿樣本的電泳圖均合格。

1.2.4 蛋白質酶解 每個樣品取100 μg蛋白。按蛋白∶酶為20∶1的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補加胰酶1次，37 ℃繼續酶解8 h。

1.2.5 SCX 應用島津LC-20AB液相系統、UltremexSCX分離柱(4.6 mm×250 mm)對樣品進行液相分離，經篩選得到12個組分。

1.2.6 液相串聯質譜(LC-MS/MS) 通過島津LC-20AD納升液相色譜儀進行分離。掃描模式為反射模式，分辨率≥30 000，每次掃描的粒子信號以4個通道分別記錄，共4次后合并轉化成數據。

1.3 生物學信息分析

1.3.1 MS/MS質譜數據檢索和定量 應用MASCOT搜索引擎檢索，所用數據庫為Swissprot人的蛋白質數據庫，鏈接地址為http:∥www.uniprot.org。應用PeakView1.1中的Protein Quantitation 1.0 MicroApp軟件進行定量，搜索相應的人數據庫IPI_human_3.87.fasta，IPI數據庫結果與Swissprot相匹配。

1.3.2 差異蛋白質界定 取DNDR、DM組樣品豐度值的均數和中位數，分別計算兩組間各個蛋白質相應的比值。設定均數和中位數差異倍數上下調均≥2.5倍為差異表達蛋白質。

1.3.3 基因本體(GO)、生化代謝和信號轉導通路注釋(Pathway) GO注釋包括3個本體，分別描述分子功能(GO-F)、生物過程(GO-P)、細胞組分(GO-C)。

1.3.4 GO、Pathway功能顯著性富集分析 應用超幾何檢驗，找出與所有蛋白質背景相比，在差異蛋白質中顯著富集的GO條目，明確差異蛋白質與哪些生物學功能顯著相關。以京都基因與基因組百科全書(KEGG)中的Pathway為單位，找出與所有鑒定到的蛋白質背景相比，在差異蛋白質中顯著性富集的Pathway，通過Pathway顯著性富集確定差異蛋白質參與的最主要的生化代謝和信號轉導通路。

1.3.5 蛋白質互作網絡分析使用 應用Medusa.jar軟件進行蛋白質互作網絡分析，網址為http:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/GeneRIF/。

1.3.6 差異蛋白質驗證 采用ELISA法檢測兩組血漿中角蛋白1(KRT1)和蛋白二硫鍵異構酶(PDI)的表達，按試劑盒說明在標準實驗室完成，驗證蛋白質組學分析結果。

2 結 果

2.1 Label-free血漿蛋白質譜檢測和鑒定 比較DNDR組與DM組樣品的豐度值，共篩選出差異表達蛋白質49個，其中上調35個，下調14個。見表1。

表1 差異表達蛋白質

2.2 GO注釋和富集分析 GO富集分析顯示，差異表達蛋白質涉及22種GO-P，包括生物粘連、生物調節、細胞成分組織或生物發生、細胞過程、發育過程、建立定位、生長、免疫系統過程、定位、運動、代謝過程、多生物過程、多細胞生物過程、生物過程的負調節、生物過程的正調節、生物過程的調節、再生、再生過程、對刺激的響應、韻律過程、信號傳遞、單一生物過程，其中單一生物過程占絕對優勢；涉及13種GO-C，包括細胞、細胞部分、細胞外基質(ECM)、ECM部分、細胞外區域、細胞外區域部分、大分子復合物、膜、膜部分、腔上內膜、類核、細胞器、細胞器部分、抗氧化活性，其中細胞外區域占比最高；涉及9種GO-F，包括結合或催化活性、電子載體活性、酶調節劑活性、分子換能器活性、受體活性、結構分子活性、載體活性，其中結合蛋白占比最高。

2.3 Pathway注釋和富集分析 Pathway富集到了多個代謝通路。Papilin(PAPLN)為上調最明顯的蛋白質，但未富集到相關代謝通路。下調最明顯的PDI在內質網蛋白質加工Pathway，PDI和內質網氧化還原酶1(ERO-1)驅動內質網中蛋白質二硫鍵的形成。ERO-l借助黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性反應將電子從PDI經歷幾種硫醇-二硫化物交換反應轉移到分子氧，氧的不完全還原導致超氧陰離子自由基形成，后者可以轉化為過氧化氫或其他活性氧，引起內質網中蛋白質折疊誘發的氧化應激，進而在內質網的蛋白質加工中起作用。

2.4 差異蛋白質相互作用網絡分析 APOC2、CST3、ADAMTSL4、KRT1、GP5、IGJ、ECM1、CPS1、GAPDH、SERPINA3之間有相互作用。

2.5 ELISA法驗證血漿KRT1、PDI水平 DNDR組血漿KRT1水平顯著高于DM組(P<0.05)，血漿PDI水平顯著低于DM組(P<0.05)，見表2。ELISA法驗證結果與Label-free蛋白組質譜檢測結果基本一致。

組別NKRT1 PDIDNDR85.78±0.46①2.55±0.21①DM6 2.02±0.1216.38±1.83

與DM組比較：①P<0.05

3 討 論

Christensen等[1]報道215例伴微量白蛋白尿的糖尿病患者中80%伴DR，El-Asrar等[2]的研究發現，87%的PDR患者伴有DN，表明糖尿病患者中DR與DN共患病的比例很高。DR和DN是致盲和終末期腎病最重要的病因之一，嚴重影響患者的生活質量。研究[3]結果表明，嚴格控制血糖可降低DR和DN的發生風險，但并不能完全阻止其發生與進展。臨床中也發現不少糖尿病患者持續高血糖卻不發生微血管并發癥。在單卵雙生雙胞胎中，DRDN有一致的患病率[4]，表明兩者的發生具有一定的遺傳傾向和家族聚集性。Label-free蛋白質組定量技術根據質譜的豐度來對肽段或蛋白質進行相對定量，能夠同時對多種蛋白質進行檢測，血漿中特定蛋白質組及其濃度的變化對多基因病的發生和發展有著重要的預警作用。本研究以DR伴DN的患者作為研究對象，行血漿蛋白質組學檢測，篩選DN伴DR的相關蛋白質，為進一步發現DR、DN共病的血漿標志物和新的治療靶點提供依據。

本研究共篩選出49個DR伴DN差異表達蛋白質，以均數和中位數差異倍數作為篩選條件，避免了因樣本量較少所致的數據偏倚。蛋白質組研究中一般以差異倍數1.2～3.0倍作為篩選條件，為了在大量蛋白質中過濾出差異顯著的蛋白質，避免剔除有意義的蛋白質，本研究選擇差異倍數上下調均≥2.5倍作為篩選標準[5]。本研究在GO功能富集的基礎上，通過GO、Pathway顯著性富集分析確定了相關蛋白質的功能和參與的生化代謝途徑。差異表達蛋白質相互作用網絡分析顯示多個差異表達蛋白質有相互作用，富集性分析發現一種蛋白質可以參與多個GO或Pathway，也可以多種蛋白質屬于一個GO或Pathway，表明DNDR的發生和發展是多種蛋白質相互作用的結果。在49個差異表達蛋白質中，少數蛋白質已有文獻報道與DR、DN有關，如RBP4與DR發病有關[6]， CysC與DN有關[7]，S100A9與DR、DN有關[8]，本研究也發現上述蛋白質存在差異表達。

除上述蛋白質以外，本研究還發現其他一些差異蛋白質，需要進一步驗證。KRT1存在于表皮的上層、內皮細胞的表面和神經母細胞瘤NMB7的細胞膜中，與皮膚的結構完整性有關。KRT1可調節蛋白激酶C的活性，參與凝集素途徑的補體激活、纖維蛋白溶解、血管生成和對氧化應激的反應。KRT1基因變異可引起表皮松解性魚鱗病等皮膚病變。研究[9]發現，中國漢族人群KRT1的變異和KRT1的特異性多態性與系統性紅斑狼瘡和系統性硬化癥有關。另有研究[10]發現，玻璃體內注射雷珠單抗治療的PDR患者，玻璃體中KRT1水平升高。本研究發現DNDR組患者血漿中KRT1水平明顯升高，可能通過炎性反應、纖維蛋白溶解、血管生成和對氧化應激等機制參與DR、DN的發病。

ECM1是一種糖蛋白，參與許多生物過程，與乳腺癌、肝細胞癌等腫瘤有關。有學者收集了10例2型糖尿病患者的尿液樣本，分為正常、微量和大量白蛋白尿，將他們的尿蛋白質組與10名健康個體進行比較，在大量白蛋白尿患者尿液中檢測到ECM1[11]。還有研究發現，ECM1可影響系膜細胞增殖，但其與DR的關系鮮見報道，本研究檢測到DNDR組中ECM1上調，其在DN、DR中的作用機制有待進一步研究。

SERPINA3蛋白又名α1-抗胰蛋白酶，是人血漿中蛋白酶抑制劑——組織蛋白酶G的抑制劑，參與ECM蛋白質的降解。SERPINA3可降低細胞間的黏附，抑制細胞凋亡，因此與惡性腫瘤的發生密切相關， SERPINA3蛋白是典型的急性炎性反應蛋白質，在炎性反應時明顯增加[12]。研究發現，炎性反應和ECM的重建在動脈瘤性蛛網膜下腔出血中起作用。本研究中，DNDR組SERPINA3表達上調，且差異表達蛋白質相互作用網絡分析顯示SERPINA3與ECM有相互作用。蛋白質相互作用網絡分析提示，APOC2、CST3、ADAMTSL4、KRT1、GP5、IGJ、ECM1、CPS1、GAPDH、SERPINA3有相互作用，結合上述蛋白質的功能分析，推測在DR伴DN的發生和發展中，上述蛋白質可能通過致動脈粥樣硬化、促進新生血管形成、影響凝血系統、炎性反應、免疫反應等機制共同作用導致DN伴DR的發生和發展。

本研究發現，上調最明顯的蛋白質為Papilin，在Pathway富集性分析中未發現其參與代謝通路。目前對Papilin的研究較少，發現其主要存在于基底膜中。Papilins與幾種ECM成分和ADAMTS酶相互作用，對胚胎發育至關重要。下調最明顯的蛋白質PDI是普遍存在的氧化還原酶，主要定位于內質網，在蛋白質折疊中起關鍵作用。血小板和內皮細胞在血管損傷時分泌PDI，分泌的PDI激活脈管系統中的多個ECM，從而啟動血栓形成[13]。PDI的過表達可以保護移植細胞免于缺氧和其他可能發生的內質網應激，并因此增強其再生特性[14]。本研究DNDR組患者PDI表達明顯下調，其機制需進一步研究。

本研究基于Label-free定量技術，結合生物信息分析，篩選出血漿中49個DN伴DR差異表達蛋白質，這些差異蛋白質提供了DR伴DN候選血漿標志物，并可能成為干預的新靶點。DR伴DN的發生和發展是多種因素相互作用的結果，通過相互作用網絡和GO、Pathway富集分析，挑選出KRT1、ECM1、SERPINA3、PAPLN、PDI等差異表達蛋白質可能在DR伴DN共同發病中發揮重要作用。本研究采用ELISA法對差異表達蛋白質KRT1、PDI進行驗證的結果與質譜分析結果一致，提示采用Label-free定量技術尋找DR伴DN相關血漿標志物是有效和可行的。本研究樣本量較少，差異表達蛋白質需要在擴大樣本的患者中進行驗證后確定其在DN伴DR發病中的作用。