加載促生長激素神經(jīng)肽的介孔二氧化硅納米顆粒藥物載體對高糖環(huán)境下神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響

段 淏 趙玉武

近年來糖尿病的發(fā)病率不斷升高，隨之而來的糖尿病神經(jīng)病變發(fā)病率也急劇升高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。高血糖是造成糖尿病神經(jīng)病變的主要誘因[1]，其原因主要是高濃度的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[2]。已有研究證實(shí)，長期高血糖可引起背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元損傷[3-4]，影響體外DRG神經(jīng)元的軸突生長，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、線粒體功能障礙，甚至引起細(xì)胞凋亡[5]。促生長激素神經(jīng)肽(GAL)不僅參與體內(nèi)血糖和能量的調(diào)節(jié)，對多種類型的細(xì)胞外損傷亦具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。Xu等[7]應(yīng)用體外培養(yǎng)的高葡萄糖濃度處理的DRG神經(jīng)元模型，研究了GAL對DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)、細(xì)胞活力和凋亡，以及GAL及其受體(GALR1和GALR2)表達(dá)的影響。結(jié)果表明，外源性GAL抑制了高葡萄糖引起的不良效應(yīng)，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。有序介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)具有很好的生物相容性、較高的藥物加載量和很好的藥物緩釋性能，其介孔結(jié)構(gòu)對于多肽藥物具有很好的保護(hù)作用[8-10]。本研究首先制備了由聚乙二醇(PEG)修飾的生物相容性高、載藥量大、緩釋能力強(qiáng)的MSNs(MSNs/PEG)藥物載體，隨后加載GAL制備MSNs/GAL/PEG藥物載體，研究后者對高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 MSNs的合成和樣品表征 將0.862 4 g十六烷基三甲溴化銨(CTAB)溶入149.5 g去離子水中，再加入25 mL乙二醇和7.2 mL NH3·H2O溶液，50 ℃下攪拌0.5 h，逐滴加入1 mL正硅酸乙酯(TEOS)。50 ℃下攪拌2 h，然后轉(zhuǎn)入到反應(yīng)釜在100 ℃烘箱水中熱處理24 h。10 000×g離心15 min，經(jīng)無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥。采用酸醇萃取法除去CTAB后，將樣品置于60 ℃真空干燥箱中干燥。使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM，型號(hào)為S-4800，日本電子株式會(huì)社)和透射電子顯微鏡(型號(hào)為JEM-2100F，日本電子株式會(huì)社)進(jìn)行樣品表征，加速電壓分別為5和200 kV。

1.2 制備MSNs/PEG并進(jìn)行生物相容性檢測 將溶解在10 mL DMSO的80 mg甲氧基PEG琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)加入合成的MSNs/氨基(NH2) DMSO溶液中，室溫下持續(xù)攪拌12 h。離心收集沉淀，用無水乙醇洗4次除去殘留的PEG，隨后真空干燥。分別用200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 和0 μg/mL的MSNs/PEG處理DRG神經(jīng)元細(xì)胞24和48 h，采用CCK-8(cell counting kit-8)細(xì)胞活性檢測法檢測其細(xì)胞活性。

1.3 制備MSNs/GAL/PEG并測定GAL的加載量 將制備成功的40 mg MSNs/PEG溶解到15 mL PBS中，用攪拌和超聲的方法使其分散均勻，隨后與2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的含GAL的PBS溶液混合后，在室溫下攪拌12 h。10 000×g離心收集沉淀得到加載了GAL的MSNs/PEG(MSNs/GAL/PEG)，并用PBS洗3次后于室溫下真空干燥過夜。在加載前后的GAL溶液中，使用甘丙肽ELISA試劑盒測定MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量。

1.4 MSNs/GAL/PEG的緩釋性能測試 通過半透膜外部GAL質(zhì)量濃度的變化來檢測體外MSNs/PEG藥物載體對GAL的緩釋性能。實(shí)驗(yàn)具體操作方法：10 mg制備好的MSNs/GAL/PEG分散在4 mL PBS(pH值7.4)中，通過攪拌和超聲處理使其完全分散。隨后，將其放入預(yù)先處理好的透析袋中，并將透析袋浸透在6 mL PBS中，37 ℃下緩慢攪拌，分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)取出4 mL透析袋外側(cè)的溶液，使用甘丙肽ELISA試劑盒測定GAL的質(zhì)量濃度。

1.5 MSNs/GAL/PEG對高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響 分析MSNs/GAL/PEG納米藥物載體對高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響，具體操作方法：在孕15 d的Wistar大鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)胚胎中分離得到DRG神經(jīng)元細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶和0.3 mg/mLⅠ型膠原酶在37 ℃下消化DRG神經(jīng)元細(xì)胞10 min。隨后加入FBS至10%以停止消化，1 000×g離心后收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中[含有2% B-27補(bǔ)充劑，10 ng/mL神經(jīng)生長因子(NGF)和1 mmol/LL-谷氨酰胺]，并使用無菌改良巴斯德玻璃吸管研磨，用130 目過濾器過濾細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)。在神經(jīng)基底細(xì)胞培養(yǎng)基中，葡萄糖濃度為25 mmol/L時(shí)對DRG神經(jīng)元細(xì)胞的存活和生長最為有利，因此本研究將此葡萄糖濃度稱為正常，并用于對照組。高糖組、高糖+MSNs/PEG組和高糖+MSNs/GAL/PEG組的培養(yǎng)基中均添加最終濃度為45 mmol/L的葡萄糖。培養(yǎng)12、24、48、36、60和72 h后，采用CCK-8測定各組DRG神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 合成的MSNs 樣品表征結(jié)果顯示，合成的MSNs的形貌為球形，粒徑均勻，粒徑為90～120 nm。合成的MSNs粒徑均一，孔徑分布良好。見圖1。

A、B 透射電子顯微鏡表征圖像 C FE-SEM表征圖像圖1 不同放大比例和不同電子顯微鏡下粒徑為100 nm的MSNs納米顆粒的表征圖像

2.2 MSNs/PEG生物相容性檢測 用200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 和0 μg/mL的MSNs/PEG處理DRG神經(jīng)元細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性分別為99.60%±3.29%、98.95%±1.17%、96.99%±0.68%、105.80%±0.39%、103.20%±1.57%、100.92%±2.08%、102.49%±8.85%、107.72%±6.34%，48 h后的細(xì)胞活性分別為94.48%±0.84%、95.45%±1.29%、94.32%±1.22%、94.32%±1.41%、94.00%±1.94%、95.13%±1.84%、94.00%±2.23%、99.03%±2.02%。結(jié)果表明，在0～200 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，MSNs/PEG對神經(jīng)元細(xì)胞均無毒性。

2.3 MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量測定 ELISA法檢測結(jié)果顯示，每毫克MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量為3.26 μg。

2.4 MSNs/GAL/PEG的緩釋性能測試 緩釋性能測試結(jié)果顯示，1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h后，MSNs/GAL/PEG半透膜外部GAL質(zhì)量濃度分別為(3.58±1.46)、(10.77±1.11)、(54.80±2.32)、(61.70±2.58)、(63.67±2.52)、(66.61±1.37)、(66.82±2.00)、(67.55±2.02)、(69.80±1.76)、(69.64±3.73)、(71.57±3.70) ng/mL。結(jié)果表明，在pH值7.4、37 ℃的條件下，該藥物載體在0～10 h之間有一個(gè)快速釋放GAL的過程，10 h 后GAL的質(zhì)量濃度一直維持在恒定的范圍內(nèi)。

2.5 MSNs/GAL/PEG對高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)12、24、48、36、60和72 h后，對照組的神經(jīng)基底細(xì)胞培養(yǎng)基中DRG神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)分別為(62.69±5.97)×104、(68.56±3.34)×104、(87.91±6.80)×104、(141.25±16.34)×104、(183.78±12.02)×104、(265.45±7.19)×104，高糖組中分別為(55.71±1.23)×104、(52.77±8.39)×104、(58.61±12.21)×104、(66.59±7.41)×104、(77.59±4.02)×104、(114.37±13.27)×104，高糖+MSNs/PEG組中分別為(58.05±13.96)×104、(55.81±4.67)×104、(63.61±11.46)×104、(68.6±4.84)×104、(77.00±7.02)×104、(115.86±8.76)×104，高糖+MSNs/GAL/PEG組中分別為(60.82±2.87)×104、(63.16±0.72)×104、(84.69±16.35)×104、(127.59±12.12)×104、(164.29±8.21)×104、(241.93±20.88)×104。高糖+MSNs/GAL/PEG組培養(yǎng)36、48、60、72 h后的DRG神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)均顯著多于高糖組和高糖+MSNs/PEG組同時(shí)間點(diǎn)(P值均<0.05)，但與對照組各時(shí)間點(diǎn)間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。結(jié)果表明，MSNs/GAL/PEG納米藥物載體可以明顯加快高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞的增殖。

3 討 論

糖尿病周圍神經(jīng)病變的機(jī)制目前尚未明確，神經(jīng)缺血、糖還原酶的激活、氧化應(yīng)激損傷、自身免疫和神經(jīng)營養(yǎng)因子減少均可能參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展，而能夠?qū)⒀强刂圃诶硐胨绞菧p少糖尿病合并周圍神經(jīng)病變的基礎(chǔ)[11]。研究[11]結(jié)果表明，糖尿病患者易發(fā)生氧化應(yīng)激，在血糖水平急劇波動(dòng)或持續(xù)高血糖的狀態(tài)下，機(jī)體可以通過糖化氧化或自氧化作用使糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA的損傷。

GAL被稱為神經(jīng)元肽，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括心理調(diào)節(jié)、能量平衡，調(diào)節(jié)胰島素分泌，以及影響神經(jīng)元損傷、生存和再生等神經(jīng)保護(hù)作用[12]。研究[13]結(jié)果表明，GAL對多種細(xì)胞外損傷刺激具有神經(jīng)保護(hù)作用。提示，GAL對于治療糖尿病神經(jīng)病變具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

蛋白和多肽類藥物在體內(nèi)容易降解，因此，如何構(gòu)建具有良好生物相容性、緩釋效果好、對蛋白多肽藥物具有保護(hù)作用的藥物載體是這類藥物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。無機(jī)納米材料具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒子大小和形態(tài)易于控制、易于表面功能化等方面的優(yōu)勢，且具有獨(dú)特的光學(xué)、磁學(xué)、電學(xué)和物理學(xué)性能，近年來在化學(xué)藥物、DNA和蛋白質(zhì)等傳遞方面的應(yīng)用越來越受到重視[14]。MSNs作為一種新型材料，其特定的介孔結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定的性質(zhì)和良好的可塑性，表現(xiàn)出了較傳統(tǒng)藥物納米載體無可比擬的優(yōu)越性，成為潛在的新型藥物傳遞系統(tǒng)材料[15]。MSNs是一種粒徑為10～600 nm、孔徑為2～50 nm的二氧化硅粒子，具有較大的比表面積，較高的比孔容和載藥量，均一、可調(diào)的孔徑，以及較好的生物相容性[19]，其在體內(nèi)可生物降解，降解產(chǎn)物硅酸可被人體吸收，也可經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄。Lee等[16]研究結(jié)果顯示，0.1 mg/mL的MSNs在體外模擬體液中7 d內(nèi)即可完全降解。MSNs已成為近年來極具潛力的藥物載體。

本研究首先構(gòu)建了生物相容性高、載藥量大、緩釋能力強(qiáng)的MSNs/PEG藥物載體，隨后在MSNs中加載GAL制備MSNs/GAL/PEG藥物載體，應(yīng)用高葡萄糖濃度處理的DRG神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型，采用CCK-8細(xì)胞活性檢測法評(píng)價(jià)MSNs/GAL/PEG藥物載體對高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞增殖的影響。本研究構(gòu)建的MSNs粒徑為90～120 nm，介孔形貌均一。MSNs/PEG具有極高的生物相容性，在0～200 μg/mL質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)，MSNs/PEG對神經(jīng)元細(xì)胞均無毒性。每毫克MSNs/GAL/PEG中GAL的加載量為3.26 μg，提示其具有較高的GAL加載能力。緩釋性能優(yōu)異的藥物載體可以長時(shí)間緩慢地釋放藥物，減少藥物降解，降低局部藥物濃度，改善藥物不良反應(yīng)，提高藥物利用率。本研究結(jié)果顯示，MSNs/GAL/PEG藥物載體在0～10 h之間有一個(gè)快速釋放GAL的過程，10 h后GAL的質(zhì)量濃度一直維持在恒定的范圍內(nèi)；提示，本研究所構(gòu)建的MSNs/PEG納米藥物載體對GAL具有良好的緩釋性能。高糖環(huán)境會(huì)造成DRG神經(jīng)元細(xì)胞損傷，直接的表現(xiàn)就是細(xì)胞增殖受到抑制。本研究結(jié)果證實(shí)，MSNs/GAL/PEG藥物載體可以明顯加快高糖環(huán)境下DRG神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，顯著改善高糖環(huán)境對DRG神經(jīng)元細(xì)胞的影響。

本研究探索構(gòu)建MSNs作為GAL的載體，具有非常大的潛在應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床藥物研究提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，其毒理學(xué)和藥理學(xué)研究也為藥物的臨床研究提供了具有重要價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。