腺苷A3受體活化對潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜5-羥色胺的影響

任天華 呂敏敏 安曉萌 肖 鵬 林燕生 司徒偉基

潰瘍性結腸炎(UC)多見于中青年，主要癥狀為反復血便、腹瀉、腹痛等，嚴重影響患者的生活質量且耗費大量醫療資源，其病因和發病機制目前尚不明確。既往研究結果顯示，UC患者的結腸黏膜腺苷A3受體(A3AR)表達異常[1]，A3AR激活可顯著減輕動物結腸炎性反應[2]，表明A3AR在結腸炎發病機制中可能發揮重要作用。A3AR表達于結腸黏膜和腸嗜鉻細胞(EC細胞)[3-4]。已知EC合成和分泌5-羥色胺(5-HT)，而5-HT在UC發病中起重要作用[5-7]。體外細胞實驗發現，A3AR可調控EC細胞釋放5-HT[3]。A3AR能否調節UC患者結腸黏膜5-HT，目前尚不清楚。本研究旨在探討A3AR激動劑1-[2-氯-6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-1-脫氧-N-甲基-β-D-呋喃尿酰胺(2-Cl-IB-MECA)對結腸黏膜5-HT的影響，以明確A3AR在UC發病中的作用及其機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 UC診斷標準參照歐洲克羅恩和結腸炎組織(ECCO)在2012年發布的UC共識[8]。選擇2016年6月—2018年1月在香港大學深圳醫院就診并行結腸鏡檢查的患者，其中活動期UC患者18例(UC組)，健康體格檢查者11名(對照組)。UC組男11例、女7例；年齡24～68歲，平均年齡為(45.3±12.0)歲；病程0.5～11年，平均病程為(4.5±3.1)年。本研究獲香港大學深圳醫院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測結腸黏膜TNF-α和IL-1β水平、5-HT含量 和釋放量 經結腸鏡檢查獲取UC組和對照組的結腸黏膜組織，將其置于37 ℃、體積分數為0.05的CO224孔組織培養板中，于1 000 μL含有10%FBS(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1 640培養基中孵育。取部分UC組的結腸黏膜組織，在其培養基中加入2-Cl-IB-MECA(100 nmol/L, 英國Tocris公司)處理24 h(UC+2-Cl-IB-MECA組)，對照組和另一部分UC組的結腸黏膜組織僅以培養基孵育。收集培養液，離心獲取上清液，應用ELISA試劑盒(美國RayBio公司)測定TNF-α和IL-1β水平，應用酶免疫測定試劑盒(美國ENZO公司)測定5-HT釋放量；收集結腸黏膜組織，制備結腸黏膜組織勻漿，按照酶免疫測定試劑盒說明書步驟測定5-HT含量。

1.2.2 檢測結腸黏膜中A3AR、5-HT和色氨酸羥化酶1(TPH1)的表達 采用免疫熒光法檢測A3AR、5-HT和TPH1在結腸黏膜中的表達。將結腸黏膜組織固定在10%的中性甲醛溶液中過夜，常規制備石蠟組織切片。將石蠟切片經脫蠟和水化后，經pH值為6.8的枸櫞酸鈉溶液高壓鍋進行抗原熱修復，置于室溫下0.1 mol/L PBS溶液(含5%正常驢血清和0.3%Triton X-100)中孵育30 min，置于4 ℃孵育一抗(均購自美國Abcam公司)過夜，使用的一抗包括兔抗A3AR抗體(1∶200)、山羊抗人5-HT(1∶1 000)和兔抗人TPH1(1∶100)。將切片以PBS溶液洗3次后，于室溫下用相應的二抗(均購自美國Jackson ImmunoResearch公司)避光孵育1 h，使用的二抗包括Alexa Fluor 488標記的驢抗兔IgG(1∶200)、Alexa Fluor 594標記的驢抗山羊IgG(1∶200)和Alexa Fluor 594標記的驢抗兔IgG(1∶200)。再將切片以PBS溶液漂洗后，用包含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光衰減試劑封片(美國Cell Signaling公司)，應用熒光顯微鏡(日本Nikon公司)進行圖像采集。免疫熒光染色后A3AR顯示綠色，5-HT和TPH1顯示紅色。

1.2.3 檢測EC細胞數量 于熒光顯微鏡下觀察5-HT的免疫反應性，5-HT免疫反應陽性細胞即EC細胞。于20倍目鏡下觀察EC細胞并計數，每張切片計數3個視野的EC細胞數量和隱窩數量，計算平均每個隱窩的EC細胞數(EC細胞數/隱窩數)。

1.2.4 檢測結腸黏膜A3AR和TPH1的蛋白質表達水平 應用蛋白質提取試劑盒(中國索萊寶公司)提取結腸黏膜組織總蛋白質，采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測總蛋白質濃度。采用Western印跡法定量檢測A3AR和TPH1的蛋白質表達水平，經SDS-PAGE分離蛋白質后，轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，置于4 ℃孵育一抗過夜，使用的一抗包括兔抗A3AR抗體(1∶200，美國Abcam公司)、兔抗Tubulin(1∶1 000，美國Cell Signaling公司)、兔抗TPH1(1∶200，美國Abcam公司)、兔抗GAPDH(1∶1 000，美國Cell Signaling公司)。用含有Tween-20的Tris緩沖鹽(TBST)漂洗后于室溫下用二抗，使用的二抗包括HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000，美國Cell Signaling公司)孵育1 h，應用ECL試劑檢測蛋白質條帶，應用Quantity One軟件定量分析圖像。A3AR相對分子質量為35 000，故選擇相對分子質量為55 000的Tubulin作為內參照，A3AR蛋白質表達水平以A3AR Western印跡條帶灰度值與Tubulin灰度值的比值表示；TPH1相對分子質量為51 000，故選擇相對分子質量為36 000的GAPDH作為內參照，TPH1蛋白質表達水平以TPH1 Western印跡條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計學軟件。

2 結 果

2.1 UC組和對照組結腸黏膜A3AR表達情況 免疫熒光染色顯示，對照組和UC組結腸黏膜中均可見A3AR表達，UC組的熒光強度弱，提示結腸黏膜A3AR免疫反應性較對照組明顯降低，見圖1。UC組結腸黏膜A3AR蛋白質相對表達量為1.27±0.19，顯著低于對照組的2.43±0.25(P<0.01)。

A 對照組 B UC組圖1 結腸黏膜中A3AR表達(免疫熒光染色，×20)

2.2 各組結腸黏膜TNF-α和IL-1β水平 UC組和UC+2-Cl-IB-MECA組的TNF-α和IL-1β水平均顯著高于對照組(P值均<0.01)，而UC+2-Cl-IB-MECA組的TNF-α和IL-1β水平均顯著低于UC組(P值均<0.01)。見表1。

組別NTNF-αIL-1β對照5102.27±22.2585.46±8.43UC10415.56±78.30①206.62±37.33①UC+2-Cl-IB-MECA10290.32±50.01①②141.22±19.85①②

與對照組比較：①P<0.01；與UC組比較：②P<0.01

2.3 各組結腸黏膜EC細胞數和5-HT含量 UC組和UC+2-Cl-IB-MECA組的EC細胞數和5-HT含量均顯著多于對照組(P值均<0.01)，而UC+2-Cl-IB-MECA組的EC細胞數和5-HT含量均顯著少于UC組(P值均<0.01)。見圖2、表2。

A 對照組 B UC組 C UC+2-Cl-IB-MECA組 圖2 結腸黏膜中EC細胞 (免疫熒光染色，×20)

組別NEC細胞數(個)5-HT含量(ng/mg)對照110.46±0.1424.69±7.08UC181.30±0.34①88.63±27.39①UC+2-Cl-IB-MECA180.85±0.21①②52.74±7.87①②

與對照組比較：①P<0.01；與UC組比較：②P<0.01

2.4 各組結腸黏膜TPH1蛋白質表達情況 免疫熒光染色顯示，UC組結腸黏膜中TPH1的免疫反應陽性細胞較對照組顯著增多，UC+2-Cl-IB-MECA組TPH1的免疫反應陽性細胞減少，見圖3。對照組、UC組、UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜TPH1蛋白質相對表達量分別為0.20±0.03、0.79±0.15、0.49±0.04，UC組和UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜TPH1蛋白質相對表達量均顯著高于對照組(P值均<0.01)，UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜TPH1蛋白質相對表達量顯著低于UC組(P<0.01)。

A 對照組 B UC組 C UC+2-Cl-IB-MECA組圖3 結腸黏膜中TPH1的免疫反應陽性細胞(免疫熒光染色，×20)

2.5 各組結腸黏膜5-HT釋放量比較 對照組、UC組、UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜5-HT釋放量分別為(15.18±3.42)、(81.16±16.62)、(39.52±8.14) ng/(mL·mg)，UC組、UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜5-HT釋放量均顯著高于對照組(P值均<0.01)，UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜5-HT釋放量顯著低于UC組(P<0.01)。

3 討 論

腸黏膜5-HT幾乎全部由EC細胞合成和貯存，5-HT的合成由色氨酸經色氨酸羥化酶(限速酶)催化生成，EC細胞釋放5-HT，作用于各種5-HT受體發揮其生物學作用[7,9]。UC患者的結腸黏膜EC細胞5-HT合成和釋放發生異常改變[6,10]，針對腸黏膜5-HT系統的藥理學或分子生物學手段能顯著影響結腸炎的嚴重程度[7,11]，證實結腸黏膜5-HT系統在UC發病機制中具有重要作用[12]。

UC患者結腸黏膜A3AR表達異常[1]。動物實驗發現，A3AR激活可顯著減輕動物結腸炎性反應的程度[2]；體外細胞實驗發現，A3AR激活可顯著減輕人結腸上皮細胞系炎性反應的程度[13]，提示A3AR在UC的發病機制中可能發揮重要作用。Ⅱ期臨床試驗發現，A3AR激動劑用于治療類風濕關節炎[14]和銀屑病[15]具有較好的療效和安全性，但尚缺乏A3AR激動劑治療UC患者的臨床試驗。

體外細胞實驗發現，A3AR能調節EC細胞5-HT釋放[3]。A3AR是否通過調節腸黏膜5-HT在UC中發揮作用尚不清楚。本研究采用UC患者離體結腸黏膜組織培養模型，觀察A3AR激動劑2-Cl-IB-MECA對結腸黏膜炎性反應的作用，結果發現UC+2-Cl-IB-MECA組的TNF-α和IL-1β水平均顯著低于UC組，表明2-Cl-IB-MECA能有效地抑制炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的產生。有研究[16]結果表明，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β在UC發病機制中起著重要作用，提示2-Cl-IB-MECA能通過抑制TNF-α和IL-1β的產生而減輕UC患者結腸黏膜炎性反應。

本研究結果顯示，UC組的EC細胞數顯著多于對照組，5-HT含量顯著高于對照組，符合UC的特點，與以往研究[10]的結果一致。UC+2-Cl-IB-MECA組的結腸黏膜EC細胞數、5-HT含量、TPH1蛋白質水平均顯著低于UC組，表明2-Cl-IB-MECA可明顯減少結腸黏膜EC細胞數和降低5-HT水平，抑制TPH1的表達。動物實驗結果表明，TPH1基因敲除小鼠的結腸炎性反應程度改善；給予5-HT前體恢復TPH1基因敲除小鼠體內的5-HT水平，結腸炎性反應程度嚴重惡化，提示降低5-HT水平可以減輕結腸炎性反應程度[7]。本研究中，2-Cl-IB-MECA可能通過抑制TPH1蛋白質表達而降低結腸5-HT水平，這可能是UC患者結腸黏膜炎性反應減輕的原因。

本研究結果顯示，UC組結腸黏膜5-HT釋放量顯著高于對照組，表明UC患者結腸黏膜釋放過多5-HT，這與以往研究[6]的結果一致；而UC+2-Cl-IB-MECA組結腸黏膜5-HT釋放量顯著低于UC組，表明2-Cl-IB-MECA能減少5-HT釋放量。5-HT具有重要的免疫調節作用，可調節多種免疫細胞分泌炎性細胞因子[17]，5-HT本身就可引起和加重腸道炎性反應[9]。因此，2-Cl-IB-MECA可能通過減少5-HT的釋放，從而減輕UC患者結腸黏膜炎性程度。

綜上所述，A3AR激活可能通過抑制5-HT合成和釋放而減輕UC患者結腸黏膜炎性反應，A3AR在UC發病機制中具有重要作用，為UC提供了治療靶點。