?？赘缴湍傅姆蛛x鑒定與乙醇發酵效率研究

張本旭 ，于紅霞 ，李夏云，邢 翔

（1.山東大學海洋學院，山東威海 264209；2.山東頤陽集團，山東威海 264400）

隨著石化資源的枯竭，人們的環保意識不斷增強。乙醇被譽為可再生綠色能源燃料，由于其燃燒污染小、容易運輸和貯藏，在價格上乙醇也可與汽油相競爭，因此具有巨大的開發前景。目前我們的工業釀酒酵母菌大都來自于陸地環境。2000 年出版的《YEASTS，Characteristics and Identification，Third Edition》中，Barnett 等人描述了678 種酵母菌，其中51 種來自海洋環境。海洋占整個地球面積的70%，其中有豐富的生物資源，包括酵母菌和酵母菌基因資源[1]。

近些年來研究表明，海洋微生物可與多種海洋無脊椎動物形成共附生關系而且可能是某些天然產物最初的合成者[2]。?？植紡V泛，從潮間帶到深淵海底、從熱帶水域到兩極海域的多種海洋環境中（包括海底熱液和冷泉）都有它們的蹤跡，而且在一些海域中生物量很大，為優勢種[3]。與海葵形成共附生關系的部分海洋酵母種類具有發酵乙醇的功能，由于海洋的高滲環境，海洋酵母菌與淡水酵母菌相比有耐鹽性好、抗逆性強等優點。本實驗將對從?？街鴮又蝎@得的4 株酵母菌的發酵性能進行比較，并選取發酵性能較好、有較大提升潛力的1 株酵母菌，優化其發酵條件，通過正交試驗找到最優發酵條件，以提升酵母菌的發酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：本實驗從黃海、渤海海域麻子港（37.534014，122.066834），南山咀（37.522151，122.163179）中采集到若干株海葵及附著層樣本，分離篩選獲得4 株海洋酵母菌。在試驗中分別命名為S4、ZE、DB、A1。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌生長曲線測定[4]

取20 個100 mL 三角瓶分別裝入30 mL 的YPD液體培養基，滅菌后編號其中一個標注為空白對照，以0.5%的接種量接種，置于28 ℃，120 r/min的培養箱中培養，每間隔4 h取出三角瓶，測定該瓶中的菌懸液OD值[5]。

按照空白對照調節分光光度計0 位，在600 nm波長下測定酵母菌不同生長時間培養液的OD600值，測定3 次取其平均值。若菌懸液濃度太高，應當適當稀釋使OD 值在0.1～0.8 之間，并記錄相應培養液的培養時間、稀釋倍數、OD600值，繪制生長曲線。

1.2.2 酵母菌發酵性能測定

1.2.2.1 CO2釋放量測定實驗

酵母菌在無氧條件下通過呼吸作用，將糖類轉化為乙醇，并放出二氧化碳，以上過程可表示為。由此式可知，通過記錄發酵過程中產生的CO2含量可計算發酵產生乙醇的含量，繼而表征發酵效率。

配制100 mL YPD 發酵培養基，按10%的接種量接入種子液，同時將未接種的發酵培養基作為對照，稱重后放入搖床培養箱中，在28 ℃、120 r/min的條件下培養。發酵過程中每隔24 h 取出稱重，直至發酵液前后質量差與對照組質量差相當，即認為發酵終止。計算排氣前后重量差，即CO2釋放量。由方程式計算可知，CO2釋放量∶乙醇=22∶23，可間接計算出乙醇產生量。

1.2.2.2 發酵液酒精度測定（酒精計法）

將發酵完成的發酵液轉移至500 mL 蒸餾瓶中，加入50 mL 蒸餾水，用減壓蒸餾裝置蒸餾出100 mL 溶液，用酒精比重計測定所得溶液的乙醇度，以及溶液溫度，換算得20 ℃時的酒精度。1.2.2.3 發酵液酒精度測定（重鉻酸鉀比色法）

酒精計法測定乙醇含量較為粗略，故選用重鉻酸鉀比色法來精確測定樣品中的乙醇濃度，此方法通過乙醇在酸性條件下與重鉻酸鉀反應生成三價鉻離子（Cr3+），鉻離子在600 nm 處有吸收峰，可利用吸光度值計算溶液中的乙醇含量。公式：

重鉻酸鉀比色法標準曲線的繪制：取0.2 g 無水乙醇加入100 mL 容量瓶中配制為體積分數為0.25%的乙醇標準溶液，由乙醇密度計算得每毫升標準溶液中有約2.0 mg乙醇。另取5 g重鉻酸鉀溶于蒸餾水中，加入10 mL 濃硫酸放置至室溫后加蒸餾水定容至100 mL，得到5 %重鉻酸鉀酸性溶液。分別向1～8號試管中加入乙醇標準溶液0～7.0 mL后，加入2.0 mL 的5 %重鉻酸鉀酸性溶液，最終定容至10 mL。將準備好的試管放置于沸水浴中加熱反應10 min，取出并冷卻至室溫，將1號管作為空白對照將分光光度計調零，其余試管于波長600 nm處測定吸光度，每組重復一次取平均值，以乙醇濃度與對應的吸光度作標準曲線[6]。

發酵液樣品乙醇含量測定：取蒸餾后產物0.25 mL 于試管中，加入2.0 mL 的5 %重鉻酸鉀酸性溶液，加水定容至10 mL，沸水浴加熱10 min 后冷卻至室溫，于波長600 nm 處測定吸光度，每組樣品平行測定3 次求平均值，后通過標準曲線計算得出樣品中的乙醇含量。

1.2.3 單因素試驗[7]

通過生長曲線的測定和發酵性能的測定，選取生長狀況較好、發酵性能較優的1 株酵母菌ZE，對影響其發酵效率的因素進行單因素條件優化。

1.2.3.1 發酵溫度的影響

菌種活化后，按照體積分數10.0%的接種量接種5 瓶YPD 發酵培養基，分別將其放置于25～38 ℃5 個發酵溫度下，以120 r/min 搖床培養24 h，每個溫度梯度做1 次平行。記錄發酵前后錐形瓶重量變化，計算CO2釋放量及乙醇產生量。

1.2.3.2 發酵碳源的影響

將葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、阿拉伯糖、半乳糖以2%的濃度分別加入基礎氮源培養基中配制成發酵培養基，并裝液于帶杜氏管的試管中。將活化后的菌液以1 %的接種量接種于試管中培養24 h，每組重復兩次，記錄杜氏管中產氣情況。

1.2.3.3 發酵氮源的影響

將培養基中的氮源分別替換為硫酸銨、硝酸鉀、尿素、蛋白胨、酵母粉以制備不同氮源的發酵培養基。菌種活化后，將它們以10.0%的體積分數接種，并置于28 ℃、120 r/min搖床培養箱中培養24 h。記錄發酵前后錐形瓶重量變化，并計算CO2排放量及乙醇產生量。

1.2.3.4 發酵培養基pH值的影響

調節發酵培養液pH4.5～6.5。菌種活化后，將其以10.0%的體積分數接種，置于28 ℃、120 r/min搖床培養箱中培養24 h，每組做1 次重復。記錄發酵前后錐形瓶重量變化，計算CO2釋放量及乙醇產生量。

1.2.3.5 發酵氮源濃度的影響

根據氮源實驗結果，選擇最適氮源，制備氮源濃度分別為1 %～5 %的發酵培養基。菌株活化后，將它們以10.0 %的體積分數接種，并置于28 ℃、120 r/min搖床培養箱中培養24 h。記錄發酵前后錐形瓶重量變化，計算CO2排放量及乙醇產生量。

1.2.3.6 發酵碳源濃度的影響

根據碳源發酵實驗結果選擇最適的碳源，配制碳源濃度分別為16%～28%的發酵培養基。菌種活化后，將它們以10.0 %體積分數接種，置于28 ℃、120 r/min 搖床培養箱中培養24 h，每組做1次平行。記錄發酵前后錐形瓶重量變化，計算CO2釋放量及乙醇產生量。

1.2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取發酵溫度、氮源濃度、發酵液pH 值3 個對發酵產量有明顯影響的因素，設計3 因素3 水平的正交試驗，采用L9(34)的正交表對酵母菌發酵條件進行優化[8]，見表1。

表1 發酵優化正交試驗因素水平設計(一)

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定OD600（圖1）

圖1 4種酵母菌的生長曲線

由圖1 可知，對于菌株A1，在培養0～4 h 為延滯期，4～28 h 為對數生長期，28～72 h 為穩定期，在試驗階段中未觀測到衰亡期。對于菌株ZE、S4、DB，在培養0～8 h 為延滯期，8～42 h 為對數生長期，42～72 h 為穩定期，未見明顯衰亡期。菌株DB、S4、ZE 相比菌株A1 在達到穩定期時的菌種數量占有明顯的優勢。

2.2 CO2釋放量測定（圖2）

圖2 CO2釋放量變化曲線

由圖2 可知，4 種酵母菌的CO2釋放量均隨著發酵時間的延長逐漸減少，即在發酵的前24 h 時，發酵效率最大，隨后產生的CO2含量減少，即單位時間發酵產生的乙醇含量減少。可推斷由于發酵產生的乙醇在發酵液中積累，隨著發酵時間的延長，發酵液中的乙醇濃度逐漸升高，而乙醇濃度的升高會抑制酵母菌的生長及其發酵過程，整個發酵過程中的CO2釋放量隨發酵時間的延長逐漸減少，因此在后續試驗中選取前24 h 的CO2釋放量作為發酵效率高低的比較指標。

在發酵開始后7 d，A1 和ZE 菌株的CO2釋放量接近0 g，在發酵開始后10 d的S4和DB菌株的CO2釋放量接近0 g，其微小的數值可能為搖瓶時的水蒸汽蒸發所致，因此可推斷A1 與ZE 在發酵后第7天、S4 與DB 在發酵后第10 天，錐形瓶重量基本不發生變化，判定認為發酵完成。

由圖2 可知，CO2日釋放量在發酵開始后5 d 時間 內ZE＞A1＞DB＞S4，之 后 有S4＞DB＞ZE=A1。另將每24 h 的CO2釋放量相加可得CO2總釋放量，其中ZE 在發酵過程中共釋放CO244.1 g、A1共釋放CO236.2 g、S4 共釋放CO231.0 g、DB 共釋放CO232.1 g，ZE 在發酵過程中釋放的CO2明顯高于其他3株酵母菌。

2.3 乙醇含量測定

由實驗測得每組試管中的乙醇含量及其在600 nm波長處的OD600值，繪制標準曲線，見圖3。

圖3 分光光度法測定乙醇標準曲線

圖3結果表明，反應中乙醇濃度在0～14 mg/10 mL范圍內，乙醇濃度與相應的OD600呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.0512x，其相關系數R2為0.9948。將測量所得樣品OD600取平均值后計算得到相應的乙醇含量A，換算成20 ℃的酒精度X，按下式計算：

式中：X為酒精度（100 mL溶液中所含的乙醇體積數）；A 為通過標準曲線計算得樣品中乙醇含量（mg）；V 為取酒樣體積（mL）；ρ乙醇為20 ℃時乙醇密度（g/mL）。

圖4 4種酵母菌的發酵液酒精度測定值

相比較酒精計測量蒸餾液酒精度和重鉻酸鉀分光光度法測量酒精度法，兩種方法所測得數值稍有偏差（圖4），可能由于酒精計測量的誤差大導致。但從數據趨勢來看，均有ZE＞S4＞DB＞A1，其中ZE 在發酵完成時的酒精度為3.676 %vol，明顯高于其他3 種酵母菌，可判斷在28 ℃、120 r/min培養條件下ZE 發酵乙醇效率較高。結合生長曲線以及CO2釋放實驗，選取生長狀況較好、發酵產量較高的ZE 菌株進行其發酵條件的優化選擇、以找到發酵的最優條件搭配。

2.4 單因素條件優化

2.4.1 發酵溫度對發酵效率的影響（圖5）

圖5 發酵溫度對ZE發酵效率的影響

溫度是菌內酶反應的速度以及菌體生長速度的重要影響因素。由圖5 可知，溫度對于菌種發酵產率有明顯的影響，當發酵溫度為33 ℃時，CO2釋放量最高，且相較其他溫度差異顯著，可推斷菌種在25～38 ℃溫度范圍內，發酵效率先升高后下降，在33 ℃附近達到峰值，因此選擇33 ℃作為最優發酵溫度。

2.4.2 發酵培養基中氮源對發酵效率的影響（圖6）

圖6 氮源種類對ZE發酵效率的影響

氮源是酵母菌合成自身所需蛋白質、核酸等含氮物質的重要原材料，不同的氮源對微生物有不同的生理學效應。實驗測試了6 種不同氮源進行發酵，其中硫酸銨、硝酸鉀、尿素為無機氮源，蛋白胨、酵母浸粉以及兩者以2∶1 的配比混合所得的混合氮源為有機氮源。由圖6 數據可知，菌種對蛋白胨和酵母浸粉以及兩者的混合氮源即3 種有機氮源較為適應，有較高的CO2釋放量即較高的發酵產量，相較硫酸銨、硝酸鉀和尿素有明顯差異。當采用混合氮源進行發酵時，CO2釋放量最高，但相較其他兩種單一氮源差異不明顯。

圖7 氮源濃度對ZE發酵效率的影響

由圖7 可知，隨著氮源濃度逐漸增加，CO2釋放量先增加后減少，在氮源濃度為3 %時達到最大，相較其他濃度下的釋放量差異明顯，因此選擇3%的氮源濃度且為蛋白胨∶酵母浸粉為2∶1 的混合氮源作為最優氮源進行后續實驗。

2.4.3 發酵培養基中碳源對發酵效率的影響

碳源是指微生物生長繁殖的營養源，為微生物提供所需的碳元素，由于不同微生物所產生酶系不同，因此利用不同碳源的程度也存在差異[9]。通過糖發酵實驗可得，在杜氏管中產生氣泡的僅葡萄糖，蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖杜氏管中均無氣泡。未產生氣泡的幾組實驗說明，該菌種可能缺少利用此類糖類的酶系，無法在該培養基中發酵產生乙醇并放出CO2，實驗中菌種可利用的碳源僅為葡萄糖，均無法將其他碳源轉化為乙醇。將碳源濃度設置為16 %～28 %，再測量每組減重。

由圖8 可知，當碳源濃度在22 %以下時，該菌種的CO2釋放量相近無明顯差異，當碳源濃度達24 %時，CO2釋放量有所下降，當碳源濃度上升至26%、28%時，該菌種CO2釋放量顯著降低，發酵效率下降。碳源濃度增高意味著培養液黏度增大、滲透壓增高、培養液中氧含量下降等物理變化，可能會影響到酵母菌的生長以及發酵效率，因此過高的

圖8 碳源濃度對ZE發酵效率的影響

碳源濃度會導致發酵效率下降。而碳源濃度在22 %以下時，未對菌種的生長及發酵產生明顯影響，而碳源作為發酵過程的底物在濃度未影響酵母菌生長及發酵時，底物濃度越大，則底物質量越大，在一定范圍內能夠使菌種發酵完全，因此選擇碳源為葡萄糖，濃度為20%進行下一步實驗。

2.4.4 發酵培養基的初始pH 值對發酵效率的影響（見圖9）

圖9 發酵液初始pH值對ZE發酵效率的影響

發酵液的pH 值會對酵母的生命活動及酶的活性產生影響，酵母菌的適宜生長條件為弱酸性，pH值過低會增加酵母細胞排除質子的能量消耗并降低酵母細胞活度以及酵母對基質的利用速率[7]。從圖9 可知，隨著發酵液初始pH 值的升高，CO2釋放量即發酵效率呈現先增加后下降的趨勢，當pH 值為5.5 時，發酵效率最高，因此選取pH5.5 進行下一步實驗。

2.5 酵母菌發酵條件優化結果（表2）

正交實驗結果如表2，發酵溫度、發酵液pH值、氮源濃度3 個因素對CO2釋放量的影響數值R 可判斷各因素對發酵效率的影響主次順序為A＞C＞B，即發酵溫度＞氮源濃度＞發酵液pH 值。較優因素組合為A3B2C1即發酵溫度為38 ℃，發酵液pH值為5.0，氮源濃度為2%，理論最優與實驗結果最優一致。

表2 正交試驗結果

2.6 分子生物學鑒定結果

經鑒定，4 株菌株分別為A1：Hanseniaspora pseudoguilliermondi；S4、ZE：[Candida]duobushaemulonis；DB：Sporobolomyces carnicolor。

3 小結

本實驗從?？鷮又蟹蛛x出4 株酵母菌，測定其生長曲線。并對4 株菌進行發酵性能的簡單測定，選取生長狀況較好、發酵產量較高的ZE 菌株進行其發酵條件的優化選擇。對其從溫度、pH、氮源、碳源等因素進行優化。最終選取發酵溫度、氮源濃度、發酵液pH 值3 個對發酵產量有明顯影響的因素，設計3因素3水平的正交試驗。結果表明，實驗菌株在發酵溫度為38 ℃、發酵液pH 為5.0、氮源濃度為2 %，葡萄糖濃度為20 %時，乙醇發酵效率較高，24 h CO2釋放量為1.826 g。上述發酵液繼續發酵7 d 至發酵終止，蒸餾發酵液采用重鉻酸鉀分光光度法測定發酵液酒精度為4.056%vol，相比原發酵配方酒精度提高了10.3%。

ZE 菌株在發酵溫度為38 ℃、發酵液pH5.0、氮源濃度為2 %，葡萄糖濃度為20 %時，發酵液乙醇濃度可達到4.056 %vol，具有良好的乙醇發酵能力。鄭虹、杜可[10]在其對高產乙醇的酵母發酵特性研究中發現，當發酵液中葡萄糖初始濃度為200 g/L，用于研究的菌株的生物量和乙醇度達到最大值，菌株的生物量在2.0 左右，而乙醇產量在8.5%左右；Oshoma[11]在其研究中，酵母對氮的最適利用濃度為0.80 gN/L，并且硫酸銨為最適氮源；Mbajiuka[12]在發酵蔗糖實驗中測定所用酵母菌最適初始溫度25 ℃、24 °Bx、pH 值4.0 時，發酵后酒精度達到10.5 %vol；而張莉、張蘭[13]在其研究中也得到相似的結論，這與本實驗中酵母的最適發酵條件有較大差別，推測是由于酵母菌的種類不同，其最適發酵條件也有所改變；鄧永東，李靜紅[14]在對1株熱帶假絲酵母菌發酵條件的研究中，其為發酵時間72 h，發酵溫度36 ℃，初始pH4，葡萄糖乙醇發酵理論得率為0.51 g 乙醇/g 葡萄糖，與本實驗結論接近。通過與其他實驗室的研究證明了本實驗的菌株有良好的發酵乙醇的能力。該菌種來源于海洋環境下分離得到的野生菌種、在未來的實驗中還可對其進行遺傳改造進一步提高其乙醇發酵能力，具有巨大的開發潛力。