桿狀病毒表達系統制備的重組禽腺聯病毒的鑒定

崔瀟婷 顧玲玲 吳萌 張繼玲 王安平

摘要：為對桿狀病毒表達系統制備的重組禽腺聯病毒進行生物學特性的鑒定，將含GFP報告基因及AAAV兩側末端重復序列的重組桿狀病毒rBac-GFP、表達AAAV結構蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP、表達AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep以感染復數為5，同時感染搖瓶培養中的昆蟲細胞Sf9，72 h后收集細胞沉淀，反復凍融3～5次后，離心取上清。經濾膜過濾、氯仿抽提和PEG沉淀后，進行電鏡觀察和Western blot分析，并體外感染雞成纖維細胞和雞肝細胞系。SDS-PAGE結果顯示，rAAAV得到了較好的純化，電鏡下可觀察到大小約20 nm的典型細小病毒樣粒子，Western blot分析數據顯示rAAAV由3個結構蛋白組成，與野生病毒相似。體外表達試驗結果顯示，rAAAV能介導GFP報告基因在雞細胞中穩定持久地表達。表明桿狀病毒表達系統制備的rAAAV具有與野生病毒相似的性質，可應用于后繼研究和開發應用。

關鍵詞：重組禽腺聯病毒;桿狀病毒表達系統;鑒定

中圖分類號：S852.65?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0153-03

收稿日期：2017-11-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31302096）;江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2013415）;江蘇省六大人才高峰項目（編號：NY-009）。

作者簡介：崔瀟婷，女，江蘇如皋人，講師，主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail：419445466@qq.com。

通信作者：王安平，博士，副教授，主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail：wap4017@163.com。

腺聯病毒（adeno-associated virus，AAV）又稱腺病毒相關病毒，作為一種新型的病毒載體，與其他重組病毒載體相比較，具有對宿主沒有致病性、免疫原性極低、宿主范圍廣、表達時間持久等優點[1]，因此被認為是一種比較理想的基因轉移載體，目前廣泛地用于基因治療和基因工程疫苗等方面的研究。rAAV已有效地轉導了小鼠和靈長類動物的多個組織和細胞，并能介導外源基因在肺臟、中樞神經系統、肝臟、視網膜及骨骼肌等器官和組織中的長期表達[2-6]。

禽腺聯病毒（avian adeno-associated virus，AAAV）于1973年由Yates等首次發現并報道[7]，AAAV的理化性質、基因組結構等與AAV基本相似，提示可作為有潛力的重組病毒載體開發應用[8-9]。目前，重組禽腺聯病毒的制備方法主要是三質粒共轉染法，即將順式（攜帶ITR 和外源基因）、反式（編碼rep和cap）和輔助基因的3 種質粒共同轉染293細胞系，這種方法成本偏高、程序較繁、不宜擴大生產，且獲得的重組禽腺聯病毒滴度偏低。2002年，Masahi 等發現Rep78在昆蟲細胞Sf9中無需輔助病毒或質粒就能支持AAV DNA復制[10]，將重組桿狀病毒/昆蟲細胞系統應用于rAAV的生產，這種方法克服了傳統三質粒法的技術難關，rAAV滴度大大提高，生產出的rAAV與使用293細胞生產得到的病毒載體在生物功能上沒有差異，桿狀病毒/昆蟲細胞懸浮生產系統被證明是一種簡單、高效、經濟的可以大規模生產的方法。

本實驗室首次利用重組桿狀病毒/昆蟲細胞系統制備rAAAV的生產，本研究對昆蟲細胞制備的rAAAV進行以系列的鑒定，為rAAAV的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體和細胞

含GFP報告基因及AAAV兩側末端重復序列的重組桿狀病毒rBac-GFP，表達AAAV結構蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP，表達AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep均由筆者所在實驗室構建并保存;Sf9細胞購自Invitrogen公司;雞胚成纖維細胞（CEF）用9～11日齡SPF雞胚制備;雞胚肝細胞系（CEL）由中國農業科學院生物制品工程技術中心提供。

1.2 工具酶和試劑

昆蟲細胞培養基Sf-900ⅡSFM（Serum free medium），購自GBICO公司;HRP標記的羊抗鼠IgG，購自康為世紀生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純級。

1.3 rAAAV-GFP的制備

參照文獻[11]的方法，將Sf9昆蟲細胞以5×105 cells/mL 的初始密度接種于搖瓶中的昆蟲細胞培養基，110 r/min 27 ℃振搖培養，至密度達2×106 cells/mL時，以MOI為5，接種3種重組桿狀病毒rBac-GFP、rBac-VP、rBac-Rep。3 d后，離心收集細胞沉淀，于-80 ℃、37 ℃反復凍融3～5次，12 000 r/min離心10 min，收集上清，即為含GFP報告基因的重組禽腺聯病毒rAAAV-GFP。

1.4 rAAAV-GFP的純化

將以上制備的病毒液先用0.22 μm的濾膜過濾，除去雜質和大分子蛋白，再加入1/10體積的氯仿在搖床上室溫劇烈振搖1 h，加入5 mol/L NaCl至終濃度為1 mol/L，12 000 r/min 離心10 min，取上層水相，加入PEG 8000至終濃度為10%，冰浴 1 h，12 000 r/min離心15 min，PBS溶解沉淀，即為純化的rAAAV-GFP。

1.5 rAAAV-GFP的電鏡鑒定

將純化的重組病毒rAAAV-GFP滴加于銅網上，經2%磷鎢酸負染后，在投射電鏡下觀察。

1.6 rAAAV-GFP的Western blot分析

取少量的rAAAV-GFP純化產物，與等體積的2×loading buffer混勻后，煮沸3 min，取15 μL進行SDS-PAGE分析，以未接種病毒的細胞沉淀作為陰性對照。樣品電泳結束后轉印PVDF膜，以鼠抗VP3多抗作為一抗，以HRP標記的羊抗鼠作為二抗，按常規方法進行Western blot分析。

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