血管內皮生長因子、基質細胞衍生因子-1基因對人微血管內皮細胞增殖、遷移、凋亡的影響

高靜，李曉嵐，王敏哲，劉貫英，楊雪松

作者單位：新疆醫科大學第五附屬醫院內分泌科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830054

近年較多動物模型在研究分析糖尿病視網膜病變發生、發展機制時，發現一些細胞因子參與調控了此過程［1-2］，其中對新生血管生成有重要作用的血管內皮生長因子（VEGF）已成為學者們的研究熱點。目前實驗資料結果已經推測VEGF可能調控了視網膜病變的形成，可能與VEGF具有提高血管通透性、促內皮細胞遷移、增殖等功能密切相關［3］，且最新研究發現在大鼠糖尿病模型實驗中，一旦抑制VEGF的表達，大鼠視網膜病變會出現顯著改善［4］。基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）是最近發現的一種由骨髓基質細胞及其他組織基質細胞分泌的細胞因子，它具有趨化活性的功能。前有研究認為，SDF-1和VEGF一樣，也參與了糖尿病大血管病變和微血管病變過程［5-7］，但其在調控的作用機制目前尚不明確，而SDF-1和VEGF之間是否存在相互調節的作用以及其相互作用機制也尚無定論。本研究自2017年1—5月對人微血管內皮細胞HMEC-1進行體外培養，分別以siRNA介導低表達VEGF、SDF-1處理細胞，觀察處理后細胞增殖、凋亡、遷移狀況的變化情況，從而為進一步探討VEGF和SDF-1在糖尿病視網膜血管病變中的可能作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內皮細胞HMEC-1購自上海信裕生物技術有限公司。從GenBank中獲得已知的人VEGF和mRNA的序列VEGF、SDF-1，VEGF165、SDF-1 siRNA由上海吉瑪公司合成，非特異隨機序列由上海吉瑪公司贈送。DMEM培養基和10%胎牛血清購自北京方程生物公司，脂質體lipofectamineTM 2000購自美國Santa Cruz公司。BCA法蛋白定量測定試劑盒、VEGF、SDF-1兔抗人抗體均購自福建邁新生物工程公司、β-actin鼠單克隆抗體購自Anbo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人微血管內皮細胞HMEC-1培養于DMEM培養基內，其中含10%FBS，細胞傳代至對數生長期開始實驗。

1.2.2實驗分組和轉染 實驗分成4組，分別為空白對照組（Ⅰ組），轉染非特異性對照組（Ⅱ組），轉染si VEGF165組（Ⅲ組），轉染si SDF-1組（Ⅳ組）。對各組的轉染操作過程如下：①在各組的6孔細胞培養板中加入生長狀態良好的HMEC-1細胞；②對Ⅱ組，Ⅲ組和Ⅳ組分別加入Scramble RNA 20 nmol/L、si VEGF165 20 nmol/L、si SDF-1 20 nmol/L，三組均加入適量Lipofect 2000TM；③24 h后收集細胞；④對Ⅰ組的人微血管內皮細胞HMEC-1不作任何處理。

1.2.3Western印跡法 采用Western印跡法檢測穩定轉染細胞株中VEGF165、SDF-1蛋白表達變化。操作過程：（1）提取蛋白：將各組細胞接種于6孔細胞培養板，加3 mL 4℃預冷的PBS洗滌細胞，加入400 μL含PMSF的裂解液，使細胞充分裂解，于4℃下12 000 r/min離心5 min，吸取上清，放于-80℃保存。（2）Bradford法測定蛋白濃度：首先把不同濃度的標準品加進96孔板中，并將待測樣品2.5 μL加進測試孔，均稀釋10倍后在測定總蛋白濃度，計算出標準曲線方程。（3）Western Blot檢測：緩慢地在樣孔中加入樣品，經過兩種不同的SDS-PAGE電泳（濃縮膠60 V；分離膠100 V），分別為5%和10%各2 h；轉印在Bio-Rad電轉儀中進行，之后封閉硝酸纖維素膜，取出漂洗3次，保存于雜交袋中，內含有1∶1 000的一抗，保持溫度4℃下，持續緩慢地搖動過夜。第二天先進行漂洗3次后將硝酸纖維素膜取出放進另外一個雜交袋中，內含有1∶2 000的二抗，溫度為室溫，緩慢地繼續搖動1 h。取出漂洗3次后以actin為內參對照，進一步顯影，感光，定影，均在暗室內操作；用Quatity One軟件對得到的圖片進行分析其條帶灰度值。

1.2.4MTT增殖檢測 取各組轉染后細胞，調制成1×105/mL細胞懸液接種在96孔培養板內，每孔加入200 μL培養基，培養的48 h后去除培養基，加入含l mg/mLMTT的培養基，37℃繼續培養4 h后，小心棄去孔內培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）液，室溫下將平板在微孔板上震蕩，使結晶物溶解后用酶聯免疫檢測儀檢測波長490 nm處測吸光度OD值，取4個復孔的平均值。抑制率＝（1-實驗孔OD值／對照孔OD值）×100%。

1.2.5流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡變化 收集轉染后各組細胞，調制濃度為2×105/mL的細胞懸液，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。PBS洗滌1次，離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定 1～2 h，離心棄去固定液，PBS 重懸 5 min。400目的篩網過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS，收集懸浮細胞。加入1 mL PI染液染色，4℃避光30 min。細胞經過PI染色后，上流式細胞儀，熒光被PI激發氬離子而產生，激光光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖，用Cellquest軟件分析處理熒光強度，得出各組細胞凋亡百分比。細胞凋亡指數（AI）＝亞二倍體峰細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6劃痕愈合實驗 收集轉染后各組細胞，在24孔板每孔接種1×105個細胞，在37℃5%CO2環境下培養24 h，在孔板中央劃一條寬度為0.8 mm的橫線，并在橫線等距離間隔作5個標記以為下一步測量做準備。繼續置于37℃5%CO2環境下培養48 h，在培養前（0 h）和培養后（48 h）均采用相差顯微鏡觀察，沿橫線邊緣作為數據測定點，測量橫線兩側的細胞間距離（μm）變化，測量時取平均值。HMEC-1的遷移距離（遷移能力）＝0 h橫線邊沿的距離-48 h后細胞遷移邊沿的距離。

1.3統計學方法數據采用SPSS18.0統計軟件進行整理分析，以±s來表示計量資料，多組間數據資料采用單因素方差分析（Anova），組間資料采用lsd-t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1Western印跡法檢測VEGF165、SDF-1蛋白的表達轉染了VEGF165-siRNA后，Ⅲ組VEGF165、SDF-1蛋白的表達強度均明顯弱于Ⅰ組和Ⅱ組，差異有統計學意義（t＝9.836，8.279，7.846，8.045，P＜0.05）；轉染了SDF-1-siRNA后，Ⅳ組SDF-1蛋白的表達強度均明顯弱于Ⅰ組和Ⅱ組，差異有統計學意義（t＝7.381，7.984，P＜0.05），而VEGF165蛋白表達變化差異無統計學意義（P＞0.05）。Ⅰ組與Ⅱ組比較，VEGF165、SDF-1蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1，表1。

圖1 si VEGF165和si SDF-1處理HMEC-1細胞24 h下調VEGF165、SDF-1的蛋白表達水平：I為空白對照組；Ⅱ為轉染非特異性對照組；Ⅲ為轉染si VEGF165；IV：轉染si SDF-1

表1 轉染后HMEC-1細胞中VEGF165、SDF-1蛋白的相對表達比較/±s

表1 轉染后HMEC-1細胞中VEGF165、SDF-1蛋白的相對表達比較/±s

注：與Ⅰ組比較，aP＜0.05；與Ⅱ組比較，bP＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組F值P值VEGF165 1.92±0.42 1.87±0.35 0.48±0.07ab 1.76±0.09 6.067 0.018 SDF-1 1.29±0.38 1.32±0.47 0.62±0.08ab 0.37±0.05ab 4.589 0.038

2.2VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內皮細胞HMEC-1增殖、凋亡的影響經siRNA轉染后，Ⅲ組和Ⅳ組細胞均出現增殖抑制率和凋亡率明顯增高，與Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。但Ⅲ組和Ⅳ組之間比較，Ⅲ組細胞增殖抑制率和凋亡率增高更顯著（t＝6.217，5.487，P＜0.05），差異有統計學意義。Ⅰ組與Ⅱ組比較，細胞增殖抑制率和凋亡率均差異無統計學意義（P＞0.05）。表明經VEGF165 siRNA和SDF-1siRNA轉染均對HMEC-1細胞增殖能力具有抑制作用，對細胞發生凋亡具有明顯的促進作用，但VEGF165 siRNA轉染的作用更顯著。見表2，圖2。

2.3VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內皮細胞HMEC-1體外遷移力的影響細胞遷移實驗中，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組遷移距離分別為（579.65±11.59）μm、（553.76±9.47）μm、（234.72±10.28）μm、（318.36±9.95）μm，Ⅲ組和Ⅳ組細胞明顯 少 于 Ⅰ 組 和 Ⅱ 組（t＝10.972，9.894，8.426，7.904，P＜0.05），差異有統計學意義，而Ⅰ組與Ⅱ組之間，差異無統計學意義（P＞0.05），其中Ⅲ組和Ⅳ組之間比較，Ⅲ組細胞明顯少于Ⅳ組（t＝5.907，P＜0.05），差異有統計學 意 義 。說明VEGF165、SDF-1表達的下調抑制了人微血管內皮細胞HMEC-1的遷移能力，且經轉染VEGF165 siRNA后的人微血管內皮細胞HMEC-1的遷移能力下降更顯著。見圖3，表3。

表2 轉染后各組HMEC-1細胞的增殖能力、凋亡情況比較/xˉ± s

表3 VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內皮細胞HMEC-1體外遷移力的影響

圖2 各組人微血管內皮細胞HMEC-1凋亡率的檢測結果：A為Ⅰ組，B為Ⅱ組，C為Ⅲ組，D為Ⅳ組

圖3 VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內皮細胞HMEC-1體外遷移力的影響檢測：A為Ⅰ組，B為Ⅱ組，C為Ⅲ組，D為Ⅳ組

3 討論

VEGF的促血管新生作用最初是1989年由研究者發現的，之后它一直是人們的研究熱點。越來越多的動物實驗以及體外實驗均已經證明了，VEGF具有促進內皮細胞的生長增殖、促血管通透及誘導血管形成的作用。VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D和PIGF，其中VEGF-A與生理/病理情況下的血管生成、血管形成密切相關［8］。VEGF基因根據不同剪接分為5種異構體：VEGF121、145、165、189及206，其中VEGF165是最為常見的形式，因其在生理病理反應中的重要作用被定義為優勢異構體。目前實驗結果推測VEGF對內皮細胞作用及新生血管形成的影響可能是糖尿病視網膜病變的發生、發展過程的機制之一［9］。SDF-1是CXC家族的趨化因子蛋白，也屬于重要的血管生成蛋白之一，主要在低氧條件下由基質細胞分泌表達，對腫瘤的生長轉移以及血管生成的調節起著重要作用［10-11］。以往研究表明［12］SDF-1能夠促進血管新生部位鄰近的血管內皮細胞遷移、增殖、形成管樣結構，并通過動員募集血管前體細胞參與血管的生成，在修復損傷的過程中起到重要作用。最新研究發生，SDF-1能夠誘導內皮祖細胞，促使它從骨髓向缺血的視網膜組織集聚，從而參與糖尿病病人視網膜血管病變發生［13-14］。現研究認為，SDF-1和VEGF的表達均參與了糖尿病大血管病變和微血管病變過程［4］，但目前對于二者之間的關系以及作用機制尚無定論。

在基因研究領域中，將外源性或內源性雙鏈RNA（dsRNA）導入細胞后，調節和關閉相應基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動，這種發生在轉錄后的基因靜寂現象被稱之為RNA干擾［15-16］。本研究為探討VEGF、SDF-1基因對人微血管內皮細胞HMEC-1增殖、遷移、凋亡中的作用，根據VEGF、SDF-1基因mRNA特點，設計了siRNA序列，分別轉染了人微血管內皮細胞HMEC-1后，結果發現轉染VEGF165-siRNA組和轉染SDF-1-siRNA組細胞均出現增殖抑制率和凋亡率明顯增高，與空白對照組和轉染非特異性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。但轉染VEGF165-siRNA組和轉染SDF-1-siRNA組之間比較，轉染VEGF165-siRNA組細胞增殖抑制率和凋亡率增高更顯著。表明經VEGF165 siRNA和SDF-1siRNA轉染均對HMEC-1細胞增殖能力具有抑制作用，對HMEC-1細胞發生凋亡具有明顯的促進作用，但其中VEGF165 siRNA轉染的作用更顯著。推測VEGF、SDF-1基因均能促進HMEC-1的增殖能力，并抑制HMEC-1的凋亡，從而在糖尿病血管病變發生發展中發揮作用，而通過轉染siRNA阻斷它們的表達，能降低微血管內皮細胞的增殖，促進細胞凋亡，可推測兩者對微血管內皮細胞的作用可能為糖尿病視網膜血病變治療提供新的靶點［17-18］。

本研究采用Western Blot方法檢測VEGF、SDF-1蛋白表達水平，結果發現轉染了VEGF165-siRNA后，Ⅲ組VEGF、SDF-1蛋白的表達強度均明顯弱于空白對照組和轉染非特異性對照組（P＜0.05）；轉染了SDF-1-siRNA后，Ⅳ組SDF-1蛋白的表達強度均明顯弱于空白對照組和轉染非特異性對照組（P＜0.05），而VEGF蛋白表達變化差異無統計學意義。表明人微血管內皮細胞HMEC-1轉染siRNA后，均出現相應基因表達的蛋白水平下降，而轉染了VEGF165-siRNA后，不僅VEGF蛋白表達水平降低明顯，同時伴隨SDF-1蛋白表達下降。這與前面提到VEGF165 siRNA轉染對HMEC-1細胞增殖、凋亡能力的作用更顯著是相符的，證明了抑制VEGF表達可以下調SDF-1表達水平，兩者之間可能存在密切聯系，VEGF對SDF-1的表達具有調節機制。

本研究細胞遷移實驗結果顯示，轉染VEGF165-siRNA組和轉染SDF-1-siRNA組細胞遷移距離明顯少于空白對照組和轉染非特異性對照組（P＜0.05），而轉染VEGF165-siRNA組和轉染SDF-1-siRNA組之間比較，轉染VEGF165-siRNA組細胞遷移距離明顯少于轉染SDF-1-siRNA組（P＜0.05）。說明VEGF、SDF-1表達的下調抑制了人微血管內皮細胞HMEC-1的遷移能力，且經轉染VEGF165 siRNA后的人微血管內皮細胞HMEC-1的遷移能力下降更顯著［19-20］。提示兩者在對微血管內皮細胞遷移能力的調節過程中，VEGF對SDF-1表達具有調節機制，這可能為尋找預防及治療糖尿病視網膜血管病變提供了新的策略［21-23］。