外用鹿茸膏劑抗小鼠皮膚衰老的實驗研究

郁兵，何鳳琴，楊章民

作者單位：1西安文理學院生物與環境工程學院，陜西 西安 710065；2陜西師范大學生命科學院，陜西 西安 710061

鹿茸是梅花鹿或馬鹿的成年雄鹿處于生長期、未骨化的幼角，是一味被祖國醫學數千年實踐所驗證的名貴中藥，其性溫、咸，味甘，具有壯腎陽、益精血、強筋健骨、調沖任、托瘡毒的作用［1］。鹿茸在生長階段生長速度很快，最多每天可以生長1～2 cm，其原因在于內部含有大量復雜的生物活性物質。近年來對中藥材抗衰老的研究非常多，如：人參、黃芪、枸杞、黃精等，現代生物學對鹿茸的研究也證明了鹿茸具有抗衰老功效［2-5］，但是對應用鹿茸全組份抗皮膚衰老的研究并不多見。本文作者認為，鹿茸是一種成分非常復雜的中藥材，其抗衰老很可能是多種組份互相協同產生的功效，本課題自2018年1月至2019年5月研究外用鹿茸抗皮膚衰老的功效，為進一步將鹿茸開發成抗皮膚衰老化妝品提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雌性昆明種小鼠30只，體質量（20±2）g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，使用許可證號：SCXK（陜）2018-001，合格證號：61001700003029。由于本研究最終目的是為了研制適用于女性的抗皮膚衰老化妝品，所以全部選用雌性小鼠作為實驗動物。小鼠的處置符合動物倫理學原則。

1.2 試驗藥物和主要試劑成年梅花鹿茸最多可以分枝兩次，第一次分枝后叫做二杠茸，該階段是鹿茸生長旺盛時期，粗灰分含量低，含有較多活性物質。根據鹿茸不同部位組織特征的差異，鹿茸切片由頂端向下依次為蠟片、粉片、血片和骨片，越靠近頂端的茸片，品質越高。試驗用鹿茸由本課題組成員到項目合作方銅川鹿苑實業有限公司現場割取，并取其中下部顏色鮮紅、血液豐富的切片——血片為試驗藥物。血片靠近鹿茸基部，品質中下，能夠代表鹿茸的基本藥效［6］。

HA測定試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司；HYP測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；SOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；D-半乳糖，上?；瘜W試劑二廠；考馬斯亮蘭，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器超微量微孔板分光光度計（Epoch，美國Bio-Tek公司）；臺式高速離心機（SF-TGL-16GS，上海菲恰爾分析儀器有限公司）；冷凍干燥儀（CTAL PH2-4/LSC，德國CHRIST公司）；遠紅外快速恒溫干燥箱（YHG-400-S，上海躍進醫療器械有限公司）；恒溫水浴鍋（SHHW21.420AⅡ，天津市泰斯特儀器有限公司）；粉碎機（FSJ-A05N6，廣東小熊電器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1分組與造模 首先將雌性小鼠適應性飼養7d，保證小鼠適應現環境后開始進行實驗。

將30只雌性小鼠按照隨機數字表分組的方法分成5組，其中4組小鼠作為造模組，皮下注射D-半乳糖1.0 g·kg-1·d-1，一共注射30 d；余下一組小鼠作為空白組，每天注射同體積生理鹽水［7-9］。30 d后造模組和空白組皮膚外觀比對，模型組明顯皮膚松弛，出現細密皺紋，而空白組則相反，見圖1。

圖1 皮膚衰老模型的建立：A為空白組小鼠；B為模型組小鼠

將4組皮膚衰老模型小鼠分為：模型組、鹿茸膏劑A、B、C組。用剪刀將小鼠背部毛發剪短，再用剃須刀剃毛備用。

1.4.2制備鹿茸膏劑 將鹿茸血茸片100 g剪切成碎片，粉碎機高速檔粉碎10次，每次1 min。精確稱取粉碎后的鹿茸組織和凡士林，充分攪拌混勻，配制成模型組（0%）、鹿茸膏劑A組（5%）、鹿茸膏劑B組（10%）、鹿茸膏劑C組（15%）4個濃度鹿茸膏劑各50 g，置于冰箱冷藏室中保存。

1.4.3皮膚外用鹿茸膏劑 選取小鼠背部中央位置4 cm×7 cm的區域，將各組膏劑涂抹在對應各組小鼠選取的皮膚區域表面，每只每天涂抹0.3 g，24 h后清潔皮膚并再次涂抹，連續涂抹21 d，期間還需手工脫毛4次。

1.4.4小鼠皮膚的表觀特征觀察 比對各組小鼠用藥部位皮膚的色澤、光滑程度、皺紋等表觀特征并拍照記錄。然后脫頸法處死實驗小鼠，迅速剝下用藥部位皮膚，去除皮下脂肪和其他結締組織，鋪平后用直徑2 cm打孔器在正中位置切取小鼠皮膚用于含水率測定，余下的皮膚于-20℃冷凍保存，用于測定HYP等成分。

1.4.5皮膚含水率的測定 精確稱量打孔器切取的皮膚濕重，隨即將其放入烘箱中，于50℃烘干12h，然后稱取干重，計算出各實驗組皮膚含水率。公式如下：

1.4.6皮膚羥脯氨酸（HYP）含量測定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，用冰浴預冷的生理鹽水進行漂洗，濾紙擦干，加入冰浴預冷的生理鹽水，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照HYP試劑盒說明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計測定OD值，計算各實驗組小鼠皮膚HYP含量。

1.4.7皮膚透明質酸（HA）含量測定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，加入冰浴預冷的PBS緩沖溶液，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下1 000 r/min離心4 min，取上清液。按照HA試劑盒說明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計測定OD值，計算各實驗組小鼠皮膚HA的含量。

1.4.8皮膚超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定 取涂藥部位皮膚組織0.5 g，用冰浴預冷的生理鹽水進行漂洗，之后加入冰浴預冷后的生理鹽水，使用玻璃勻漿器研磨成濃度為10%的勻漿液。將得到的勻漿液在0℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液。按照SOD試劑盒說明書所示方法，使用超微量微孔板分光光度計測定OD值，計算各實驗組小鼠皮膚SOD活力。

1.5統計學方法運用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量數據采用±s表示；組間比較采用單因素方差分析；方差齊性檢驗結果顯著，兩兩比較采用Dunnett T3檢驗；方差齊性檢驗結果不顯著，兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的測定/±s

表1 五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的測定/±s

注：與模型組相比較，aP＜0.01，bP＜0.05

?組別鼠數皮膚含水率/%羥脯氨酸含量/（μ g/m g）透明質酸含量/（μ g/m L）S O D活力/（U/m g）空白組模型組鹿茸膏劑A組鹿茸膏劑B組鹿茸膏劑C組F值P值事后檢驗（兩兩比較）6 6 6 6 6 7 5.4 4±0.7 3 a 5 7.7 2±0.8 9 6 6.2 2±1.2 1 b 6 8.8 2±0.6 4 a 7 0.7 0±1.0 5 a 3 8 4.3 3 0.0 0 0 L S D 4.1 6 8±0.0 6 a 3.6 0 4±0.2 0 3.8 5 0±0.3 8 3.9 5 6±0.1 2 b 4.0 8 0±0.1 2 a 1 0.8 4 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 9.2 7 3±0.2 9 a 6.1 6 3±0.5 4 6.1 6 4±0.8 0 8.5 1 4±0.6 3 b 9.0 2 4±0.2 4 a 2 5 4.2 0 9 0.0 0 0 D u n n e t t T 3 3 6 5.8 0±1 6.2 5 9 a 3 0 4.8 4±1 2.0 2 6 3 3 8.3 6±7.8 4 8 b 3 5 3.1 2±5.9 6 4 a 3 5 7.2 0±1 0.6 3 4 a 3 4.9 7 5 0.0 0 0 L S D

2 結果

2.1 皮膚外觀比較觀察各組小鼠皮膚發現：與空白組動物比較，模型組小鼠皮膚松弛，有大量褶皺，體毛再生較慢。涂抹了鹿茸膏劑的三組小鼠與模型組相比，在皮膚褶皺、光滑、松弛等方面都有較為明顯的改善，改善效果隨鹿茸含量增高而增強，以鹿茸膏劑C組最佳，結果見圖2。

圖2 各實驗組小鼠皮膚外觀的比較：A為模型組；B為鹿茸A組；C為鹿茸B組；D為鹿茸C組

2.2 鹿茸對小鼠皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力的影響測定五組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力測定結果見表1。模型組小鼠皮膚組織含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力均顯著低于空白組（P＜0.01），說明小鼠的皮膚衰老模型造模成功。鹿茸膏劑A組在皮膚含水率和SOD活力方面顯著高于模型組（P＜0.05），在HYP和HA含量方面與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）。鹿茸膏劑B組在皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面顯著高于模型組（P＜0.05），在皮膚含水率和SOD活力方面和模型組差異有統計學意義（P＜0.01）。鹿茸膏劑C組在皮膚含水率、HYP含量、HA含量、SOD活力方面和模型組差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

本實驗的結果發現空白組小鼠的皮膚光滑，較為緊致，富有彈性。注射D-半乳糖的皮膚衰老模型小鼠皮膚松弛，皺褶大量增多，在皮膚含水率、羥脯氨酸含量、透明質酸含量、超氧化物歧化酶活力等指標明顯下降。經測定，模型小鼠在外用鹿茸膏劑后，10%和15%濃度鹿茸膏劑組小鼠皮膚外觀改善的效果明顯，而且這兩個濃度組小鼠皮膚的含水率、透明質酸含量、羥脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活力等指標也得到了顯著提高。

衰老機制的假說有很多，一般認為，自由基普遍存在機體內，隨著機體的衰老，皮膚組織具有抗氧化功能的過氧化物歧化酶等成分含量下降，導致自由基大量積累，過量的自由基會過氧化蛋白質、核酸、脂質等細胞成分，從而破壞細胞膜、線粒體、染色體等細胞結構，引起蛋白質交聯變性和DNA鏈斷裂；而皮膚成纖維細胞功能的衰退，會引起羥脯氨酸生成減少，膠原蛋白合成減少，透明質酸含量下降。這些傷害在皮膚組織學方面表現為：表皮和真皮層變薄，真皮內的膠原蛋白減少，透明質酸含量下降，皮膚含水率下降，膠原纖維交聯，脂褐素堆積；于是皮膚外觀出現干燥、松弛、皺紋、暗沉等衰老癥狀［10-11］。

鹿茸本身就是處于快速生長階段的幼角，因此內部含有大量促進組織生長的生物活性物質，鹿茸的成分包括蛋白多肽類、氨基酸、糖類、生物胺類、甾體類、脂類和無機元素。蛋白多肽類是鹿茸最主要的活性成分，與抗衰老有關的主要是酶類和生長因子類。酶類包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、單胺氧化酶（MAO）等，這些酶類具有抗氧化、抗衰老作用。胰島素樣生長因子、表皮生長因子等能夠促進皮膚成纖維細胞的功能，增加膠原蛋白和透明質酸的合成。鹿茸中的糖類包括硫酸軟骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，這些成分往往具有抗氧化或者保濕的作用。鹿茸多胺可以抗脂質過氧化，促進核酸和蛋白質合成。鹿茸中的甾體類包括雌二醇、膽甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睪丸酮、膽甾-3，5-二烯，5a-膽甾-7-烯-3-酮等成分，這些激素類成分能夠抑制黑色素細胞絡氨酸酶活性、促進成纖維細胞增生和增加膠原蛋白和透明質酸合成、抑制炎癥形成、延緩皮膚衰老［12-15］。由此可見，鹿茸所含活性成分復雜多樣，其抗衰老是多種組份互相協同產生的功效，而且外用全組分鹿茸，可以起到很好的抗皮膚衰老的效果。本研究證明，鹿茸可能是一種良好的抗皮膚衰老的天然藥物。

（本文圖1，2見插圖9-1）