B7-H4在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞侵襲、遷移的影響

何濤，胡洪，謝楠，錢程，胡明，張楚悅，柯恬恬，李春滿，付必莽，蘇瑩珍

作者單位：1玉溪市人民醫院胃腸外科，云南 玉溪 653100；2昆明醫科大學第二附屬醫院，a肝膽胰外科，b麻醉科，云南 昆明 650101；3昆明學院醫學院公共衛生教研室，云南 昆明 650214

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）惡性程度極高，發現較晚，即使手術根治性切除，多數病人預后5年生存率仍不足20%［1］。B7-H4是免疫共刺激信號通路的關鍵分子之一，主要功能為負性共刺激分子，可參與細胞的周期調控、細胞增殖與凋亡以及影響細胞侵襲力等腫瘤發生的多個環節。研究發現，B7-H4蛋白在正常組織中不表達或者微量表達，但在多個腫瘤中呈高表達，同時其mRNA可在多個正常組織中被檢測到［1-3］。我們前期在肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）的研究中，發現B7-H4與ICC的形成和細胞侵襲過程有關，且B7-H4表達與腫瘤分級密切相關，可作為ICC復發早期的診斷靶分子；B7-H4異常表達能夠促進ICC細胞的體外腫瘤形成能力［2］。以上研究結果均提示B7-H4可能具有促癌基因的功能，但其與肝癌的關系尚不明確。因此，本研究結合免疫組織化學染色及細胞慢病毒抑制實驗進行研究，為此特別挑選惡性程度較高的肝癌細胞系進行篩選，進行后續細胞實驗。經過前期實驗，篩選出部分高表達B7-H4細胞株。擴大培養后進行慢病毒轉染，以期通過體外抑制B7-H4基因的表達，并分析抑制后對上述肝癌細胞在侵襲、遷移等能力上的可能影響作用。現結合具體實驗過程及結果分析并報告如下。

1 材料與方法

1.1材料收集2013年8月至2019年1月昆明醫科大學第二附屬醫院住院的肝癌病人的肝癌組織32例。人肝癌細胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7購自中科院昆明細胞庫；PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3肝癌細胞株購自中國科學院上海細胞庫；細胞培養基DMEM、RPMI-1640培養基、胎牛血清及GAPDH單克隆抗體購自昆明貝爾吉生物公司；Trizol試劑和慢病毒轉染試劑polybrene購自上海翊圣生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；實時熒光定量PCR引物、慢病毒載體設計合成與驗證均由北京安必奇生物科技有限公司完成；細胞裂解液（RIPA）、胰酶消化液和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；兔抗單克隆抗體，購自美國BD公司；ECL成像系統，由上海天能科技有限公司提供；Transwell小室購自于美國Corning公司。

1.2免疫組織化學染色（1）取材及病理：將32例肝癌術后肝癌組織標本放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成蠟塊。（2）免疫組化方法：石蠟切片脫蠟和水化，修復抗原，滴加封閉液。加滴B7-H4一抗液，4℃過夜。再PBS沖洗3次，滴加二抗，PBS沖洗3次。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。每次實驗均做陽性與陰性對照，陽性細胞質著色為棕黃色，每例均設有HE切片作對照觀察。（3）免疫組化結果判斷標準：采用雙盲法觀察切片，B7-H4免疫組化在細胞膜上染黃色或褐色。實驗樣本根據細胞染色強度和細胞染色比例獨立評分。根據被染色細胞在細胞總數中所占的比例進行評分即1%～25%，25%～50%，50%～75%和＞75%分別評分為0、1、2、3和4分。該細胞染色的強度由顏色程度來確定，即無、弱、中、強評分分別為0、1、2和3分。每個病人綜合得分為0～7分，將B7-H4低組的分數定為≤3分，B7-H4高組得分＞3分。

1.3肝癌細胞的培養、篩選及沉默HCCLM3、SMMC-7721、Huh-7三種肝癌細胞使用DMEM高糖培養基培養，余下細胞均使用RPMI-1640培養基培養。分別在適宜條件下培養上述細胞，將培養好的細胞分瓶培養在6孔板中待細胞融合率為70%～80%時，收取蛋白利用WB法，篩選B7-H4各細胞表達量。同時將細胞采用隨機數字表法分組轉染慢病毒，分別為對照組、shRNA-1抑制組、shRNA-2抑制組。培養篩選后的各組細胞并觀察細胞狀態，分別實施轉染操作。shRNA-1序列：5′-GCTAATGACAGAGAGAGGATC-3′，shRNA-2序列：5′-GAACGTCAGTGTAGAGTATGA-3′。shRNA-1組、shRNA-2組分別轉染上述對應抑制序列，對照組只加轉染試劑。具體過程：（1）培養細胞并計數，以1×105/孔在24孔板中培養，并最終達到2×105/孔；（2）配置polybrene轉染液，使其終濃度達到6 μg/mL，轉染時先用polybrene替換原培養基，加入目的基因病毒懸液，繼續培養；（3）6 h后，加入1.5 mL新鮮培養基；（4）繼續培養1 d，并用新鮮培養基培養細胞；（5）轉染至2 d后進行熒光觀察，并收集轉染熒光最強時的各組細胞進行后續細胞功能實驗。

1.4WB法及RT-PCR法檢測B7-H4抑制效率取上述各組細胞并提取蛋白，同時行蛋白定量。加蛋白上樣緩沖液混勻，沸水加熱變性。配置WB膠版并上樣，每孔約30 μg，110 V恒壓電泳，220 mA恒流轉膜。PVDF膜于TBS-T液漂洗10 s，脫脂牛奶封閉1 h，孵育目的抗體和內參，4℃孵育過夜。第二日TBS洗膜3次，TBS-T洗膜1次，加入二抗，室溫孵育1 h，再次分別洗膜，曝光條帶分析結果，篩選最適宜細胞HCCLM3進行下步實驗，RT-PCR實驗結果也與上述實驗結果一致。

1.5細胞侵襲及遷移能力分別采用Transwell細胞侵襲試驗和細胞劃痕試驗。細胞侵襲試驗，Transwell小室放置于預先制備好Matrigel基質膠的24孔板中，按上述條件培養箱中過夜，向Transwell小室下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM高糖培養基。用無血清的DMEM高糖培養液重懸各組細胞，取100 μL細胞懸液（細胞總數約1×105個）加至Transwell的上室。48 h后去除下室中的培養液，將小室置于4%的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內室膜上的細胞，結晶紫溶液（0.1%）染色10 min，PBS緩沖液漂洗后，顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5個視野拍照，統計并分析。細胞劃痕試驗，在6孔板中培養前述肝癌細胞，將細胞在無血清中持續饑餓24 h后使用移液槍頭進行劃傷，再用PBS洗滌，在0、24、48 h使用相差顯微鏡進行拍照。隨后通過手動計數進行細胞抑制率的測定，相關結果用百分比表示，上述所有實驗均常規進行3次。

1.6統計學方法采用SPSS19.0統計軟件分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1肝癌中B7-H4表達與臨床病理特征的相關性32例肝癌組織中，有14例被染色，染色陽性率為43.75%，其中，強陽性8例，中等及弱陽性6例，同時，該研究中有5例肝癌復發病人。表1的結果表明，腫瘤的BCLC分期等和B7-H4的表達密切相關（P＝0.013）。B7-H4在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，肝癌中B7-H4表達越高，病人術后越容易復發，見圖1。

圖1 肝癌病人中的B7-H4表達情況，可見B7-H4表達越高越容易復發（A為免疫組織化學×200；B為免疫組織化學×400）

2.2HCC細胞篩選B7-H4的表達量上述各組肝癌細胞的B7-H4相對表達量見圖2，從結果可見HCCLM3和PLC/PRF/5兩株細胞B7-H4表達量較高。

2.3慢病毒載體抑制細胞B7-H4表達情況HCCLM3的WesternBlot相對表達量：對照組（5.32±1.03）、shRNA-1組（1.42±0.29）、shRNA-2組（2.06±0.68），而PT-PCR結果：對照組（7.21±0.38）、shRNA-1組（1.71±0.25）、shRNA-2組（2.27±0.38）。PLC/PRF/5組與HCCLM3組結果相似。shRNA-1組、shRNA-2組均被抑制，shRNA-1組抑制明顯（P＜0.05）。見圖3～6。

表1 32例肝癌中B7-H4表達與臨床病理特征的相關性/例

圖2 不同肝癌細胞系中的B7-H4表達情況

圖3 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制（WB）

圖4 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制（RT-PCR）

圖5 肝癌細胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制（WB）

圖6 肝癌細胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制（RT-PCR）

2.4慢病毒載體抑制B7-H4表達對HCCLM3和PLC/PRF/5細胞侵襲能力的影響HCCLM3對照組的細胞數為（365±21）、shRNA-1組（128±8）；PLC/PRF/5組的細胞數為（267±44）、shRNA-1組（79±12）。與對照組相比較，shRNA-1組可明顯抑制HCCLM3和PLC/PRF/5的細胞侵襲能力（P＜0.01）。見圖7，8。

2.5慢病毒載體抑制B7-H4表達對HCCLM3和PLC/PRF/5細胞遷移能力的影響HCCLM3對照組的細胞遷移率為（82%±13%）、shRNA-1組（44%±6%）；PLC/PRF/5對照組細胞遷移率為（77%±9%）、shRNA-1組（41%±6%）。與對照組相比較，shRNA-1組明顯抑制HCCLM3和PLC/PRF/5的細胞遷移能力（P＜0.05）。見圖9，10。

圖7 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組侵襲情況（×200）

圖8 肝癌細胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制后的各組侵襲情況（×200）

圖9 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組遷移情況圖（×100）

圖10 肝癌細胞PLC/PRF/5慢病毒載體抑制后的各組遷移情況（×100）

3 討論

B7-H4是B7家族近年來最新發現的新型共免疫分子，其主要定位于細胞膜及細胞質。數年來，其研究重點在于共免疫分子機制上，很少關注到該分子在腫瘤發生發展中的詳細機制。該分子一般不在組織中表達，但其在多數腫瘤中呈現高表達。如結腸癌、ICC等［1-2，4］。我們在對結腸癌的研究中，發現該分子可能參與結腸癌的肺轉移過程。同時在ICC的研究中，發現其可明顯促進腫瘤進展，可參與腫瘤的EMT過程及抑制ICC細胞的凋亡。過表達B7-H4可增加ICC細胞的侵襲及轉移，同時抑制細胞凋亡過程。該過程與Bcl-2/bax的表達失調可能有關［2-6］。Qian等［7］的研究也發現，B7-H4可增加細胞內Bax表達，抑制Bcl-2表達，最終使得caspese-3表達發生改變并促進凋亡。另有研究指出，B7-H4可調節激酶1/2erk等的表達，影響腫瘤細胞凋亡過程［2，5-6］。此外，B7-H4的過表達可能與Fas/FasL信號通路相關，對細胞的凋亡同樣有一定作用［8-9］。Jeon等通過研究發現，B7-H4可誘導NF-κB信號激活。而NF-κB通路的抑制可阻止癌細胞侵襲。同時NF-κB信號傳導也與細胞EMT有關。

B7-H4可參與腫瘤發生的多個過程，如研究發現過表達B7-H4可增強細胞增殖。Zhang等［9-11］研究認為，B7-H4可能發生從細胞質-細胞核的穿梭。因其基因包含核定位序列，而核內的B7-H4與Cyclin E/D1的表達有關，參與細胞周期G/S期的調控。還有研究發現，B7-H4可促使人結腸癌SW-620及RKO的增殖。同時，體內過表達B7-H4可使裸鼠腫瘤生長加速。一些研究指出B7-H4可能與JAK2/STAT3及缺氧誘導因子HIF信號通路有關。

B7-H4的過表達還可增強腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。我們的實驗發現，過表達B7-H4可導致腫瘤細胞侵襲及轉移能力增加。我們最終發現該過程可能與細胞的EMT轉化及PI3K/AKT通路激活有關［1，4，10-12］。同時研究發現，B7-H4與CXCL-12趨化因子及其受體的轉錄及蛋白表達有關，B7-H4表達被下調后，細胞侵襲能力也隨之下調［10-13］。Kang等［14］的研究認為，B7-H4 的抑制可通過提高CD107a顆粒酶A顆粒酶B穿孔素和IFN-γ的表達和分泌水平來幫助CD8+T恢復抗腫瘤免疫。同時他們在HCC的荷瘤小鼠模型中，B7-H4的過表達可以增加實驗組的小鼠平均腫瘤體積。同時另有研究發現，通過酶聯免疫吸附試驗檢測來自93例HCC病人和55名健康志愿者的血液樣本中的循環sB7-H4水平，并統計分析sB7-H4水平與臨床病理因素、總生存期（OS）和復發時間的關系，結果表明血清中sB7-H4的表達水平可作為診斷或預測HCC病人臨床結果的獨立預測因子［14-15］。我們最新研究發現，B7-H4下調的裸鼠其肝內肝癌癌細胞向肺部轉移的傾向也會受抑制。而血清中的B7-H4與病人的臨床各指標密切相關，血清中B7-H4越高，其預后越差，越易復發。同時在后續的研究中，我們發現基于HCCLM3的肝癌細胞研究層面上，腫瘤的侵襲和轉移過程更容易在裸鼠上進行體內實驗，相比其他細胞系來說，可以更好的研究B7-H4的遠處轉移和腫瘤細胞侵襲與遷移的抑制。

本研究發現，B7-H4在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且肝癌中B7-H4表達越高，病人越容易復發。同時，抑制B7-H4后，HCCLM3肝癌細胞侵襲及遷移能力均明顯減弱，而腫瘤細胞的運動能力對腫瘤的轉移至關重要。結果表明，shRNA-1組抑制效果較為理想，shRNA-2組抑制效果較差，可能存在脫靶效應。本研究揭示可通過抑制B7-H4表達減弱HCCLM3肝癌細胞侵襲及遷移能力，這與我們以往多個研究結果基本一致。

綜上所述，慢病毒載體抑制HCCLM3肝癌細胞B7-H4表達可抑制該細胞侵襲及遷移活性，B7-H4有望成為HCC潛在的治療靶點及肝癌治療藥物研發新方向。

（本文圖1見插圖9-3）