龍血竭-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備及評價

李爭艷，陳凌云，羅靜，余曉玲

作者單位：1云南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院、昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑科，云南 昆明 650051；2云南中醫(yī)學院藥學院，云南 昆明 650200

龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen）的含脂樹皮和木質(zhì)部經(jīng)提取得到的樹脂［1］，性味甘、溫、咸、平，歸心、肝經(jīng)，具活血散瘀、定痛止血、生肌斂瘡的功效。現(xiàn)代研究證實，龍血竭具有顯著的抗炎止痛、抗菌、促進表皮修復、活血止血雙向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管新生、抗氧自由基等藥理作用［2-5］。環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）具有內(nèi)腔疏水、外部親水的特殊結構，能與多種客體分子形成包合物，具有毒副作用小、生物相容性好的優(yōu)點［6-9］。龍血竭微溶于水，本研究自2017年10月至2018年3月將龍血竭用HP-β-CD包合后，能夠使其使用方便、增加溶解度、增強療效、提高生物利用度，為后續(xù)的進一步研究提供便利。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀（自動進樣器、DAD檢測器、恒溫柱溫箱），C18色譜柱（DIKAM柱，4.6 mm×250 mm，5 μm）；電子天平（奧豪斯儀器有限公司，編號：13512747373）；8002型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；HJ-4B多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；差示熱分析儀（上海精科天美科學儀器有限公司，編號：592114042011）；DLSB-5L/10低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；電子天平（美國雙杰兄弟（集團）有限公司，編號：2007063245）；超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，編號：92J044Y）；UV-2450紫外可見分光計（SHIMADZU）。

1.2 試藥龍血竭藥材由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供；龍血素A對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號為110736-200934）；龍血素B對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號為111558-201006）；羥丙基-β-環(huán)糊精（西安德立生物化工有限公司）；包合物（自制）；甲醇（天津市富宇精細化工有限公司）；95%乙醇；乙腈（默克股份兩合公司）；冰醋酸（天津市大茂化學試劑廠）；娃哈哈純凈水；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）。

2 龍血竭包合物包合率的測定

2.1 HPLC測定龍血素A、B的含量

2.1.1色譜條件 色譜柱為DIKAMC18柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-0.5%冰醋酸（26∶74）；檢測波長：275 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；理論塔板數(shù)以龍血素A計算不低于6000。

2.1.2對照品溶液的制備 分別取龍血素A、B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成分別含龍血素A 86.4 μg/mL，龍血素B 41.2 μg/mL的混合溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 取龍血竭粉末約0.1 g，精密稱定，用甲醇使溶解并定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4包合物供試品溶液的制備 取包合物粉末約0.5 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲20 min，放冷，搖勻，用甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得包合物供試品溶液。

2.1.5HP-β-CD溶液的制備 取HP-β-CD 0.1 g，精密稱定，加甲醇使溶解并定容至25 mL，搖勻，用0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得HP-β-CD溶液。

2.1.6專屬性考察 按上述方法分別制備對照品溶液、供試品溶液、龍血竭包合物溶液及HP-β-CD溶液，分別精密吸取10 μL上述溶液于色譜儀中，結果如圖1所示。

2.1.7線性關系 分別取龍血素A、龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成分別含龍血素A 86.4 μg/mL龍血素B 41.2 μg/mL的混合溶液。分別精密吸取1、2、5、10、15、20、25 μL不同體積上述對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定龍血素A、龍血素B色譜峰積分面積。以龍血素A、龍血素B的進樣量為橫坐標，其峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（見圖2）。結果龍血素A對照品的回歸方程為Y＝3 735.9X-6.052 7（R＝0.999 9），表明在0.086 4～2.16–g范圍內(nèi)，龍血素A峰面積與進樣量有良好的線性關系；龍血素B對照品的回歸方程為Y＝3 131.7X-22.62（R＝0.999 9），表明在0.041 2～1.03 –g范圍內(nèi)，龍血素B峰面積與進樣量有良好的線性關系。

2.1.8穩(wěn)定性試驗 取龍血素A、B對照品，包合物供試品適量依法制備對照品溶液和包合物供試品溶液，于第0、4、8、12、16 h，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，結果表明對照品龍血素A、B，包合物龍血素A、B的RSD分別為1.14%、1.88%、1.02%、1.25%，穩(wěn)定性良好。

2.1.9重復性試驗 取同一批次包合物粉末6份，各0.5 g，精密稱定，按2.1.4項下包合物供試品制備方法制備樣品，按2.1.1項下的色譜條件進行進行龍血素A、B的含量測定，結果表明包合物龍血素A、B的RSD分別為1.24%，1.15%。該方法的重復性良好。

2.1.10準確度試驗 取同一已知含量的龍血竭HP-β-CD包合物（含龍血素A 0.528 2 mg/g，龍血素B 0.595 9 mg/g）9份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入對照品溶液（含龍血素A 86.4 μg/mL，龍血素B 41.2μg/mL）適量（5、10、15 mL三個不同水平，每個水平3份），甲醇定容到25 mL，用高效液相色譜儀測定龍血素A和龍血素B的含量，計算回收率，結果表明回收率符合規(guī)定。結果見表1，2。

圖1 龍血素A、B對照品、龍血竭藥材、龍血竭包合物及羥丙基-β-環(huán)糊精的HPLC圖譜：1為龍血素A、B對照品；2為龍血竭藥材；3為龍血竭包合物；4為羥丙基-β-環(huán)糊精

圖2 龍血素A、B線性關系

表1 龍血素A加樣回收率實驗結果

表2 龍血素B加樣回收率實驗結果

2.2 包合率的測定及計算

2.2.1包合率的測定方法 精密稱取龍血竭HP-β-CD包合物0.5 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲20 min，放冷，搖勻，取續(xù)濾液，按2.1.1項下色譜條件進行含量測定。

2.2.2包合率的計算 精密稱取龍血竭粉末0.1 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，按2.1.1項下色譜條件進行含量測定。

3 包合物制備工藝研究

3.1 單因素考察

3.1.1包合溫度對包合的影響先精密稱取龍血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密稱取HP-β-CD粉末至100 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水使其充分溶解，龍血竭與HP-β-CD主客分子質(zhì)量比為1：8，分別在30、40、50、60 ℃不同溫度下，邊攪拌邊向HP-β-CD水溶液中逐滴加入龍血竭乙醇溶液，恒溫攪拌3 h，抽濾，濾液水浴蒸干，所得粉末即為龍血竭HP-β-CD包合物。按公式計算包合物的包合率，并進行綜合評分。結果見表3。

表3 包合溫度對包合的影響

結果：由表3可知，隨著溫度的升高，包合率有所上升，但50℃到60℃變化并不明顯。收率隨溫度上升而下降，50℃到60℃有較明顯下降。綜合評分隨著包合溫度的升高而升高，但當溫度超過50℃時，綜合評分減小，40℃和60℃的綜合評分均小于50℃。綜合考慮，實驗中選擇50℃為包合的最佳溫度。

3.1.2包合時間對包合的影響 先精密稱取龍血竭粉末，加入適量95%乙醇使其充分溶解，再精密稱取HP-β-CD粉末至100 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水使其充分溶解，主客分子質(zhì)量比為1∶8，邊攪拌邊滴加龍血竭乙醇溶液，50℃下恒溫攪拌時間分別為1、2、3、4 h，抽濾，濾液水浴蒸干，即得龍血竭HP-β-CD包合物。結果見表4。

表4 包合時間對包合的影響

由表4可知，隨著包合時間的增大，包合率和綜合評分變化并不顯著，收率有所降低，考慮到2 h和4 h的綜合評分均低于3 h的綜合評分，所以實驗選擇3 h為最佳包合時間。

3.1.3包合速度對包合的影響 先精密稱取龍血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密稱取HP-β-CD粉末至100 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水使其充分溶解，主客分子質(zhì)量比為1∶8，50℃下分別用不同速度攪拌3 h，邊攪拌邊滴加龍血竭乙醇溶液，滴加完畢開始計時，抽濾，濾液水浴蒸干即得龍血竭HP-β-CD包合物。結果見表5。

表5 包合速度對包合的影響

由表5可知，隨著攪拌速度的改變，對包合率和收率均沒有太大影響，不過從表中可以看出，包合速度為400 r/min時，其包合率、收率和綜合評分均高于其余兩者，所以實驗中選擇的包合速度為400 r/min。

3.1.4主客分子質(zhì)量比對包合的影響先精密稱取龍血竭粉末，加入95%乙醇使其充分溶解，再精密稱取HP-β-CD粉末至100 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水，使其充分溶解，50℃下用中速攪拌3 h，主客分子質(zhì)量比分別為1：6、1∶8、1∶10、1∶12，邊攪拌邊滴加龍血竭乙醇溶液，抽濾，濾液蒸干，即得龍血竭HP-β-CD包合物。結果見表6。

表6 主客分子質(zhì)量比對包合的影響

由表6可知，主客分子質(zhì)量比為1∶12的綜合評分明顯低于前三組，前三組實驗的包合率、收率、綜合評分均無太大差異，質(zhì)量比為1∶8的收率和綜合評分均高于質(zhì)量比為1∶6和1∶8，綜合考慮，選擇主客分子最佳質(zhì)量比為1∶8。

3.2 包合物制備工藝條件正交優(yōu)選

3.2.1正交試驗設計 影響包合率的因素有很多，比如包合時間、包合溫度、包合速度、主客分子質(zhì)量比等因素。通過單因素考察試驗選擇包合時間、包合溫度、主客分子質(zhì)量比作為正交試驗因素，每個因素選擇三個水平：包合時間2、3、4 h（A）；包合溫度40、50、60 ℃（B）及主客分子質(zhì)量比1∶6、1∶8、1∶10（C），以包合率和包合物收率的綜合評分為評價指標，權重系數(shù)分別為0.8、0.2，進行3因素3水平L9（34）正交試驗設計，選擇最佳制備工藝。因素水平表見表7、正交試驗結果見表8、方差分析結果見表9。

表7 因素水平表

表8 正交試驗結果

表9 方差分析結果

通過統(tǒng)計分析，影響包合率的主次因素為C＞A＞B，但是A、B兩因素中的三個水平很接近，遵照操作方便原則，因素選擇A1、B1，C因素中二、三水平比較接近，所以選擇C2。最后確定包合物的制備工藝條件為A1B1C2，即包合時間2 h，包合溫度40℃，龍血竭與HP-β-CD質(zhì)量之比為1∶8。

3.2.2包合工藝驗證 根據(jù)正交試驗優(yōu)選的最佳制備工藝條件，平行制備三批包合物，并測定其包合率和包合物收率的綜合評分。結果見表10。

由表10可知，綜合評分均高于正交試驗中各試驗結果，三批包合物的包合率、收率和綜合評分的相對平均偏差較小，說明該制備工藝重現(xiàn)性好，合理可行。

表10 包合工藝驗證結果

4 包合物評價

4.1 紫外光譜掃描（UV）將適量包合物、羥丙基-β-環(huán)糊精、龍血竭與羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物以及龍血竭分別溶于水中，在室溫下于200～800 nm范圍進行紫外掃描，結果如圖3。

圖3 紫外掃描圖譜：1為包合物；2為HP-β-CD；3為物理混合物；4為龍血竭

由紫外掃描圖譜可知，包合物在285 nm左右有1個吸收峰，HP-β-CD、物理混合物、龍血竭在285 nm處沒有吸收峰，故表明龍血竭與HP-β-CD形成了新的物相。

4.2 差示掃描量熱法（DSC）精密稱取龍血竭粉末、羥丙基-β-環(huán)糊精、龍血竭羥丙基-β-環(huán)糊精的簡單混合物、包合物四個樣品各5 mg進行差示掃描熱分析：氧化鋁為參比物，量程±100 μV，升溫范圍30～350℃，升溫速率為10℃/min，得DSC圖譜，結果見圖4。

圖4 DSC圖譜：1為HP-β-CD；2為包合物；3為物理混合物；4為龍血竭

由DSC圖譜可知，龍血竭與物理混合物二者都出現(xiàn)吸熱峰，即游離龍血竭可產(chǎn)生吸熱峰。而HP-β-CD未出現(xiàn)吸熱峰，可排除載體材料的干擾。包合物沒有出現(xiàn)吸熱峰，即可證明龍血竭與HP-β-CD形成了包合物。

4.3 溶解性取10 mL水，分別精密稱取龍血竭粉末和龍血竭-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物粉末，使之成為飽和溶液，結果龍血竭幾乎不溶，龍血竭包合物的溶解度為656.74 mg/mL，明顯高于龍血竭，表明羥丙基-β-環(huán)糊精的包合對龍血竭的水溶性有顯著提高。

5 討論

在龍血竭-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備過程中，分別比較了研磨法、超聲法、中和法、飽和水溶液法和水溶液攪拌法［10-12］，分別稱取上述五種方法制備的包合物，加入適量水中使其溶解，結果顯示水溶液攪拌法制備的包合物可完全溶解，而其余四種方法制備的包合物不能充分溶解，所以本實驗選擇水溶液攪拌法制備龍血竭羥丙基-β-環(huán)糊精。

由于龍血竭微溶于水，溶出和吸收慢，導致體內(nèi)生物利用度低，而β-環(huán)糊精的“內(nèi)親脂，外親水”的立體雙親性孔腔結構可以用于龍血竭的包合，從而明顯提高龍血竭的溶解度，為該制劑的研究開發(fā)提供了一條新的制劑開發(fā)路徑。