富含鐵元素食物對(duì)非洛地平片在Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

陳仕云，何勇，于艷英，彭扶云，高永好，吳宗好

作者單位：1合肥學(xué)院分析測試中心，安徽 合肥 230601；2合肥華方醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230088

非洛地平為第Ⅱ代二氫吡啶類鈣通道阻滯藥，通過抑制小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流并增加冠狀竇血流量，降低全身冠狀動(dòng)脈血管阻力，低血壓降，具有長效、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，臨床用于輕度以及中度高血壓治療［1］。非洛地平經(jīng)胃腸道吸收快而完全，空腹服用易被肝臟代謝為非活性代謝物，從而使生物利用度降低；進(jìn)食后，食物中的有效活性成分抑制或改變藥物非洛地平的體內(nèi)代謝過程，服用葡萄柚汁［2］可引起非洛地平以及代謝產(chǎn)物的AUC和Cmax增加幾倍，是因?yàn)槠咸谚种軠p少其首過效應(yīng)，通過抑制非洛地平在腸室的代謝而起作用［1］。文獻(xiàn)報(bào)道了非洛地平餐后給藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù)試驗(yàn)［3］，本試驗(yàn)自2017年1月至2018年3月探討高鐵飲食對(duì)非洛地平片在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)的影響，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）方法［4-10］測定受試者血漿中的非洛地平濃度，分別計(jì)算空腹、餐后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，分析其差異來評(píng)價(jià)食物效應(yīng)［11］對(duì)非洛地平在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 材料非洛地平片，每片規(guī)格：5 mg（江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：20160703）；非洛地平對(duì)照品（純度99.9%，批號(hào)：100717-201403）購自中國食品藥品檢定研究院，尼群地平對(duì)照品（純度≥95%，批號(hào)：C10039115）購自上海麥克林生化科技有限公司。甲醇（色譜純，Tedia）；其它試劑均為AR級(jí)。

1.2 儀器Agilent1290-2超高壓液相色譜儀，AB4000三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（ESI+源），Analyst1.6.3數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；GL-16G型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（常州國宇儀器制造有限公司）；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x（冠森生物科技（上海）有限公司）；AG135型電子分析天平等。

1.3 試驗(yàn)對(duì)象健康Beagle犬，雌雄各半［安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002］。試驗(yàn)前Beagle犬在SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周。于試驗(yàn)前12h禁食，試驗(yàn)過程中自由飲用去離子水。本研究對(duì)犬的處置符合動(dòng)物學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 方法

1.4.1液相色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱島津C18（1.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水相（4 mmol/L醋酸銨，含0.15%甲酸）＝85∶15；流速∶0.5mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離源（ESI源），正離子檢測模式；檢測模式多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣流速：25.0 L/min；碰撞氣流速中等；噴霧電壓：5 500.0 V；離子源溫度：500.0℃；霧化氣：Gas1 50.0 L/min；輔助氣：Gas2 50.0 L/min；掃描時(shí)間：100.0 ms；監(jiān)測離子對(duì)m/z384.1→m/z338.1（非洛地平），m/z361.2→m/z 315.2（尼群地平）；去簇電壓分別為77 V和85 V；碰撞能量分別為14 V和17 V。

1.4.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用隨機(jī)、開放、單劑量給藥、雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將健康Beagle犬12條，體質(zhì)量（20±2）kg，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B兩組，每組6條。A組依次空腹給藥、高鐵食物餐后給藥；B組依次高鐵食物餐后給藥、空腹給藥，洗脫期為7 d，給藥量均為每片5 mg。

試驗(yàn)前1 d所有受試者Beagle犬進(jìn)入飼養(yǎng)動(dòng)物房，正常飼養(yǎng)，確保試驗(yàn)前禁食不禁水10 h以上。于次日早晨A組用200 m L溫水送服非洛地平片1片；B組于給藥前30 min統(tǒng)一進(jìn)食高鐵試驗(yàn)餐（5 g紫菜-200 mL去離子水），并于30 min內(nèi)進(jìn)餐完畢后立即服藥。除給藥前1 h至給藥后1 h外任意飲水，4 h后統(tǒng)一飼養(yǎng)。于給藥前0和給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24、48 h前腿靜脈處采集血樣約3 mL。血樣置于含EDTA抗凝管中，立即在3 000 r/min條件下離心10 min，分取上層血漿，于-20℃保存，備用。

1.4.3血漿樣品預(yù)處理 精密量取血漿200 μL，內(nèi)標(biāo)物10 μL，混合混勻；加甲醇600 μL，渦旋3 min；3 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm膜濾，10 μL進(jìn)樣分析（避光操作）。

1.4.4溶液配制 非洛地平標(biāo)準(zhǔn)溶液：取非洛地平對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液Ⅰ（300 μg/mL）。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液Ⅰ1.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液Ⅱ（30 μg/mL）。精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液Ⅱ適量，用甲醇稀釋即得。

內(nèi)標(biāo)物溶液：取尼群地平對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解、稀釋定容刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）。精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.1 mL，置100 mL棕色量瓶中，甲醇稀釋、定容至刻度，搖勻，得內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL）。

1.4.5方法專屬性 依次取6條受試犬空白血漿200 μL，按“血樣處理”項(xiàng)下方法（未加內(nèi)標(biāo)物溶液），參照2.1項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，得色譜圖1A；將內(nèi)標(biāo)物溶液和一定濃度非洛地平標(biāo)準(zhǔn)溶液加至空白血漿中，依次操作，得色譜圖1B；取口服給藥后受試犬血漿樣品并加內(nèi)標(biāo)物，依次操作，得色譜圖1C。空白血漿中代謝物質(zhì)、內(nèi)源性物質(zhì)不干擾血漿內(nèi)標(biāo)物和非洛地平測定，非洛地平、內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間為6.8 min和5.5 min。

1.4.6線性試驗(yàn) 取空白血漿200 μL，分別加非洛地平標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液10 μL，配置相當(dāng)于非洛地平血漿濃度1.0、2.0、50、10.0、20.0、30.0 ng/mL的模擬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以非洛地平濃度（C，ng/mL）為橫坐標(biāo)，非洛地平與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（R）為縱坐標(biāo)，計(jì)算直線回歸方程，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＝0.064 43X+0.255 77，r＝0.999 4。結(jié)果表明，非洛地平血漿濃度在1.0～30.0ng/mL范圍之間與峰面積線呈線性關(guān)系，相關(guān)性較好，定量限1.0 ng/mL。

1.4.7方法精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿200 μL于試管中，加非洛地平儲(chǔ)備溶液適量，配成高、中、低3個(gè)濃度（非洛地平濃度分別為25.0、10.0、1.0 ng/mL）模擬血漿的樣品，各5份，進(jìn)行樣品測定。代入方程，計(jì)算濃度，測得值/加入值計(jì)算回收率，連續(xù)3 d配樣測定、計(jì)算日內(nèi)差、日間差。結(jié)果顯示：準(zhǔn)確度在85%～115%范圍內(nèi)，日內(nèi)、日間差RSD均小于15%。

1.4.8回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 分別配制高、中、低濃度（25.0、10.0、1.0 ng/mL）非洛地平對(duì)照品溶液（含內(nèi)標(biāo)物）A；取空白血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，吹干后并加入非洛地平和內(nèi)標(biāo)對(duì)照溶液，分別制備高、中、低濃度血樣B；取空白血漿，分別加入適量藥和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，按“血樣處理”項(xiàng)下方法操作，分別制備低、中、高濃度血樣C。依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算非洛地平基質(zhì)效應(yīng)為93.4%～108.9%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為96.7%～105.3%；非洛地平的萃取回收率為75.76%～81.44%，內(nèi)標(biāo)的平均萃取回收率為83.6%。

1.4.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別配制低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，于室溫條件下放置8 h、經(jīng)反復(fù)凍融3次、-20℃保存15 d后測定。結(jié)果顯示，非洛地平血漿樣品，在室溫放置8 h、反復(fù)凍融3次上、-20℃保存保存15 d條件下穩(wěn)定，不影響試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

采用DAS3.2.8軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)，用非房室模型參數(shù)計(jì)算，根據(jù)各受試犬血藥濃度實(shí)測數(shù)據(jù)計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。得主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。兩組Beagle犬給藥后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)方差分析和t檢驗(yàn)，Cmax、AUC0-12和AUC0-∞，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組的Cmax、AUC0-12和AUC0-∞明顯比正常組低，說明實(shí)驗(yàn)組的吸收程度不如正常組，食物中的Fe3+可能抑制非洛地平吸收。

表1 12條Beagle犬空腹和高鐵飲食后口服非洛地平片5 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)/（n＝6，±s）

表1 12條Beagle犬空腹和高鐵飲食后口服非洛地平片5 mg的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)/（n＝6，±s）

參數(shù)Tmax/h Cmax/（ng/mL）T1/2/h AUC0-12/（ng·h-1·mL-1）AUC0-∞/（ng·h-1·mL-1）空腹1.25±0.24 12.59±2.17 1.1±0.69 19.46±5.23 20.69±5.75高鐵飲食后1.32±0.35 7.13±2.96 1.2±0.72 11.87±3.85 12.76±4.18 F值0.294 17.014 0.128 10.381 10.613 P值0.599 0.002 0.728 0.009 0.009

3 討論

本研究每片非洛地平5 mg，屬于小劑量制劑，給藥后血藥濃度比較低，選擇液-質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)行血樣定量分析；此研究的方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確。非洛地平和內(nèi)標(biāo)均見光易分解，整個(gè)樣品處理過程中應(yīng)在避光條件下快速進(jìn)行；因此，采用沉淀法處理血漿樣品，操作簡單，提取回收率高，而血漿中的內(nèi)源性成分或代謝產(chǎn)物不干擾檢測。

分析藥時(shí)曲線圖和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可知，與空腹相比較，高鐵食物組Beagle犬對(duì)非洛地平的吸收相對(duì)較差，達(dá)峰濃度降低，其相對(duì)生物利用度（F）（61.0±12.7）%；查閱相關(guān)文獻(xiàn)［12-13］，F(xiàn)e3+在酸性條件中可將二氫吡啶類化合物氧化，推測富含F(xiàn)e3+食物在酸性條件下可將非洛地平氧化成雜質(zhì)［14］，說明食物中的Fe3+抑制了非洛地平吸收。降解雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制見圖2。

圖1 血漿中非洛地平和內(nèi)標(biāo)尼群地平的典型色譜圖：A為空白血漿；B為空白血漿加入非洛地平（15 ng/mL）和內(nèi)標(biāo)尼群地平（10 ng/mL）；C為受試犬服藥后2 h血漿加入內(nèi)標(biāo)尼群地平（10 ng/mL）

圖2 降解雜質(zhì)路線圖

由此推測，食用含有Fe3+食物后［15-16］，服用二氫吡啶類藥物，降解雜質(zhì)或有關(guān)物質(zhì)增加，可影響生物利用，也可能是二氫吡啶類藥物不良反應(yīng)［14］較多原因之一。因此口服非洛地平片建議餐前服用或餐后補(bǔ)充維生素C消耗體內(nèi)Fe3+［17］。