藏紅花素預處理減輕大鼠胃缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號通路的關系

徐曼秋，蘇貞，甄玲玲，費素娟

作者單位：1徐州醫科大學研究生學院，江蘇 徐州 221002；2徐州醫科大學附屬醫院消化內科，江蘇 徐州 221002

胃缺血再灌注（GI-R）損傷是臨床常見的組織器官損傷之一，常見于失血性休克、敗血癥、消化性潰瘍進程中的出血、胃腸道缺血性疾病、器官移植等。目前認為其發生與氧自由基過量生成，血管內皮細胞和中性粒細胞間的相互作用，線粒體功能障礙，鈣超載等多種因素有關。組織缺血再灌注損傷過程中各種因素聯合作用，使得損傷逐漸加重，如不及時治療，可能會導致組織壞死。因此尋找減輕缺血再灌注損傷的保護措施對于防治器官缺血再灌注損傷具有重要意義。

藏紅花是一種鳶尾科番紅花屬的草本植物，藏紅花素（crocin）是其主要成分，具有保護心肌、抗腫瘤、抗焦慮抑郁等作用［1］。研究發現crocin具有抗氧化作用，其可減少氧自由基的產生，誘導白血病細胞凋亡［2］。此外，藏紅花可通過抑制細胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷［3］。因此，有必要探究crocin對胃缺血再灌注損傷的保護作用。本實驗自2017年10月至2018年11月研究crocin對胃缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制，從而為胃缺血再灌注損傷的防治提供新的思路和策略。

1 材料

1.1 實驗動物健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量180～220 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號SCXK（魯）2014 0007。大鼠每6只1籠，室溫、晝夜節律條件下飼養，自由飲水攝食。實驗前動物禁食24 h，不禁水。所有大鼠處置符合動物倫理學原則。

1.2 主要試劑藏紅花素（crocin）購自Sigma公司，LY294002、TdT介導dUTP缺口末端標記（TUNEL）試劑盒、BCl-2、Bax、p-Akt抗體購自碧云天生物技術有限公司。PCNA小鼠單克隆抗體、超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產分析純。crocin使用前用生理鹽水配制成所需濃度，LY294002使用前用DMSO配制成所需濃度。

2 方法

2.1 實驗分組取30只SD大鼠采用隨機數字表法分為5組，每組6只。（1）假手術組（Sham組）：僅分離腹腔動脈，持續90 min；（2）胃缺血再灌注組（GI-R組）：無創動脈夾夾閉腹腔動脈缺血30 min后，松開動脈夾再灌注1 h；（3）溶劑對照組（Vehicle組）：注射生理鹽水（NS）前10 min腹腔注射DMSO，缺血前30 min腹腔注射NS；（4）藏紅花素預處理組（crocin組）：缺血前30 min，腹腔注射給藥crocin（15 mg/kg），缺血30 min，再灌注1 h；（5）藏紅花素預處理聯合PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002組（crocin＋LY組）：crocin預處理前10 min，腹腔注射LY294002（20 mg/kg），缺血前30 min crocin預處理，缺血30 min，再灌注1 h。

2.2 胃缺血再灌注損傷模型建立參照Du等［4］方法并作相應改進。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪毛消毒后于劍突下沿腹部正中線切開，用無齒平頭鑷把胃提出切口外，打開后腹膜，分離出腹腔動脈。用無創動脈夾夾閉腹腔動脈30 min后去除，恢復血流再灌注60 min。實驗結束后取胃，沿大彎側剪開，置于冰上展平，冰冷的NS沖洗干凈，計算胃黏膜損傷指數。

2.3 胃黏膜損傷指數測定參照Du等［5］方法加以改進。以腺胃區局限于胃上皮的點狀糜爛、潰瘍、出血灶的長度累積計分：正常為0分，損傷小于1mm計1分，1～2 mm計2分，2～3 mm計3分，余類推。損傷寬度超過1 mm時分數加倍。每組大鼠損傷分數的平均值為損傷指數。

2.4 免疫組織化學染色法觀察胃黏膜細胞增殖測量完損傷指數的胃沿胃小彎剪開，一半腺胃置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5μm切片，間斷貼片于多聚賴氨酸處理的載玻片上備用。另一半腺胃在冰上快速剪取胃黏膜，置-80℃冰箱備用。免疫組化PCNA染色步驟按北京中杉金橋生物技術有限公司提供的超敏二步法免疫組化檢測系統進行。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。光鏡下觀察到胞核內有棕色顆粒者，即為陽性細胞。運用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統對陽性細胞進行半定量分析，以陽性細胞數占視野中細胞總數的百分比作為分析指標。

2.5 胃黏膜細胞凋亡的形態學檢測胃組織石蠟切片（5 μm），常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。余下按TUNEL試劑盒說明書操作完成后，于光鏡下觀察到細胞完整、體積縮小固縮成團或形成凋亡小體、胞核呈棕黃色即凋亡陽性細胞。分析方法同上。

2.6 胃黏膜組織MDA含量和SOD活性測定取出已制備好的胃黏膜，用生理鹽水制成10%的勻漿，每個標本取100 μL，用于胃黏膜組織MDA含量的測定。用生理鹽水制成1%的組織勻漿，每個標本取30 μL，用于測定胃黏膜組織的SOD活力。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性測定采用羥胺法。嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.7 Western Blot法檢測胃黏膜組織Bcl-2，Bax，p-Akt蛋白的表達按Wang等［6］方法加以改進。將胃黏膜組織剪碎后，加入蛋白裂解液（每100 mg組織加1 mL裂解液）進行勻漿，勻漿后在4℃離心機離心后取上清即為蛋白提取液。己制備的蛋白提取液測蛋白濃度后，將各樣品用勻漿液稀釋至相同濃度，加入1/3體積的4×蛋白變性液95～100℃水浴變性5 min；將煮好的蛋白加入上樣孔，保持每個孔所上的蛋白總量和體積一致；電泳結束后，以濕轉移法轉至PVDF膜上，加入3%BSA中室溫封閉2 h；加入一抗（Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶500、p-Akt 1∶1 000），4℃孵育過夜。一抗孵育過夜后，1×TBST洗滌3次×10 min；分別加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗滌3次×10 min后顯色曝光。采用BandScan軟件進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值反映蛋白表達水平。

2.8 統計學方法采用SPSS16.0軟件進行分析，所得數據以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組胃黏膜損傷指數與Sham組相比，GI-R組胃黏膜損傷指數增加（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜損傷指數降低（P＜0.05）。crocin+LY組較crocin組胃黏膜損傷指數增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組胃黏膜損傷指數

3.2 各組胃黏膜細胞凋亡情況與Sham組相比，GI-R組胃黏膜細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜細胞凋亡率降低（P＜0.05）。crocin+LY294002組胃黏膜細胞凋亡率較單用crocin組升高（P＜0.05）。見圖2，3。

圖2 胃黏膜細胞的凋亡變化（TUNEL法，×400）：A為假手術組；B為胃缺血再灌注組；C為溶劑對照組；D為藏紅花素預處理組；E為藏紅花素預處理聯合LY294002組

圖3 胃黏膜細胞凋亡率的變化

3.3 各組胃黏膜細胞增殖情況與Sham組相比，GI-R組胃黏膜細胞增殖率降低（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜細胞增殖率升高（P＜0.05）。crocin+LY294002組胃黏膜細胞增殖率較單用crocin組降低（P＜0.05）。見圖4，5。

圖4 各組胃黏膜細胞增殖情況（免疫組織化學，×400）：A為假手術組；B為胃缺血再灌注組；C為溶劑對照組；D為藏紅花素預處理組；E為藏紅花素預處理聯合LY294002組

圖5 胃黏膜細胞增殖率的變化

3.4 胃黏膜組織MDA含量、SOD活性的變化與Sham組相比，GI-R組胃黏膜組織MDA含量升高、SOD活性降低（P＜0.05）。與GI-R組相比，crocin組胃黏膜組織MDA含量降低、SOD活性升高（P＜0.05）。crocin+LY組胃黏膜組織MDA含量較單用crocin組升高、SOD活性降低（P＜0.05）。見圖6。

3.5 各組胃黏膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況與Sham組比較，GI-R組大鼠胃黏膜組織Bcl-2蛋白表達減少（P＜0.05），Bax蛋白表達增多（P＜0.05）。與GIR組相比，crocin組大鼠胃黏膜組織Bcl-2的表達增加（P＜0.05），Bax的表達減少（P＜0.05）。與單用crocin組比較，crocin+LY組胃黏膜組織Bcl-2的表達減少（P＜0.05），Bax的表達增加（P＜0.05）。見圖7。

圖6 胃黏膜組織MDA含量、SOD活性的變化：A為MDA含量變化；B為SOD活性變化

3.6 各組胃黏膜組織p-Akt蛋白表達情況與Sham組比較，GI-R組大鼠胃黏膜組織p-Akt蛋白表達增強（P＜0.05）。與GI-R組比較，crocin組p-Akt蛋白表達增加（P＜0.05）。與crocin組比較，crocin+LY組p-Akt蛋白表達減弱（P＜0.05），見圖8。提示crocin對抗大鼠胃缺血再灌注損傷的保護作用可能與其上調PI3K/Akt信號通路活性有關。

圖7 各組胃黏膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況：A和B為Bcl-2蛋白表達情況；C和D為Bcx蛋白表達情況

4 討論

機體組織器官正常代謝的維持以及功能與結構的完整性有賴于良好的血液供應。各種原因引起的局部組織器官缺血常會導致局部組織細胞代謝異常，造成不同程度的損傷。因而為阻止損傷進一步加重或促使其恢復，常需采取各種措施恢復血液灌注。實踐證明，這種治療方式在許多情況下取得了良好的效果。但大量的動物實驗和臨床觀察中也發現，一定條件下恢復血液再灌后，部分動物或病人組織細胞缺血性損壞未減輕或恢復，反而進一步加重。研究發現，這可能與恢復血液供應后，氧自由基生成增多，清除減少，過量的氧自由基攻擊組織內的細胞有關。生物膜上含有多種脂質，脂質中又含有各種不飽和脂肪酸，自由基可與脂肪酸發生反應，進行過氧化作用，導致膜的運輸功能紊亂和喪失。而其中線粒體內膜最易受到氧自由基的攻擊。氧自由基可誘發線粒體膜通透性轉換孔開放，線粒體內膜外的小分子物質大量進入內膜，導致線粒體結構受損和功能紊亂，細胞色素C和凋亡誘導因子釋放，激活下游凋亡級聯反應［7］。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產物引起細胞損傷。膜脂過氧化分解的終產物之一是丙二醛（MDA），因而測定MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是機體內清除氧自由基的特異性酶，其活性高低間接反映機體清除氧自由基的能力，因而其活性被認為是一種評估抗氧化能力的指標。多項研究表明crocin能減少細胞內氧自由基的產生，降低MDA的濃度［8］，增強SOD的活性［9］。本實驗中，crocin組SOD活性較GI-R組升高、MDA含量降低。crocin＋LY組SOD活性較crocin組降低、MDA含量升高。表明crocin可增強胃黏膜組織的抗氧化能力和組織抗損傷的效應，而LY294002能抑制其抗氧化的作用。

圖8 各組胃黏膜組織p-Akt蛋白表達情況：A為蛋白電脈圖；B為各組線條圖

PI3K/Akt信號通路是細胞內的重要信號轉導途徑，在細胞增殖、黏附、能量代謝、蛋白合成、促生存等過程中起重要作用［10］，酪氨酸激酶受體、非酪氨酸激酶受體、胰島素受體等胞外信號可激活PI3K。Akt是PI3K信號通路中一個重要的下游靶點，PI3K的活化促使第二信使磷脂酰-3，4，5-三磷酸的形成從而進一步促進Akt的Thr308和Ser473位點磷酸化，進而激活 Akt［11］。激活的 Akt可通過抑制線粒體釋放細胞色素C等凋亡相關因子、調節Bcl-2家族成員的活性等多種途徑抑制細胞凋亡。

Bcl-2家族是影響細胞凋亡的一個關鍵調節因子，它包括抗凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如：Bax、Bak、Bad）兩類蛋白。研究發現，線粒體凋亡途徑過度激活在缺血再灌注損傷中發揮重要作用，Bcl-2和Bax是調節線粒體途徑細胞凋亡的重要分子。缺氧以及缺氧復氧能夠增加Bax的表達并使其從胞質易位到線粒體，與Bcl-2的同源結構域結合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，增加線粒體膜對細胞色素C的通透性，啟動細胞凋亡過程［12-14］。而Akt的激活可使Bax的Ser184位點磷酸化，使Bax與Bcl-2解聚，停留在細胞質中與Bcl-xl等形成異源二聚體，促進細胞存活［15］。本實驗中，與GI-R組比較，crocin提高了p-Akt的蛋白表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax表達，而LY294002可減弱crocin的該作用。說明crocin抑制胃黏膜上皮細胞凋亡、對抗GI-R損傷的作用可能與其上調PI3K/Akt信號通路活性有關。

綜上所述，crocin減輕大鼠缺血再灌注損傷的作用機制可能與其通過上調PI3K/Akt信號通路活性，清除氧自由基，增強胃黏膜組織的抗氧化能力，上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，抑制細胞凋亡等有關。但其具體機制仍需進一步深入研究。

（本文圖2，4見插圖9-1）