食蟹猴急性心肌梗死模型的建立及護理

王成舟

(1. 浙江大學醫學院附屬第二醫院科研部, 杭州310009； 2. 浙江大學, 杭州310029)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)模型是以結扎冠狀動脈，達到部分心肌組織因急性缺血缺氧導致心肌組織細胞死亡，類似人類AMI 臨床事件的模型特點。在動物非臨床試驗的心肌梗死模型中，常見以小鼠、大鼠、兔、貓、犬、小型豬為報道多見，隨著在低等實驗模型中取得的成就，越來越需要高等非人靈長類心肌梗死模型的出現。在非人靈長類動物中食蟹猴較比獼猴以身體體型小、來源豐富、易于馴化等優勢，也漸漸被研究科學工作者選定為理想的高等動物實驗模型。食蟹猴(Macaca fascicularis), 是與人類最為接近的物種之一，在生理學、解剖學、免疫學以及神經學等方面有很高的相似度，在生物醫學研究領域也是比較理想的實驗動物，利用其建立的動物模型被廣泛用于研究人類疾病,如在傳染病、心血管疾病、內分泌疾病、生殖疾病、神經疾病及眼疾病等方面，對比歐美發達國家，中國具有相當豐富的靈長類動物資源提供國內外應用[1]。用食蟹猴建立的人類疾病動物模型有利于觀察疾病及其并發癥的發生發展規律，同時為治療藥物的療效檢驗和醫學研究提供可靠的保證，而且，由于食蟹猴心臟解剖特點和生物學特性與人相似： 心臟體質量比例大，冠狀血管粗大明顯, 手術操作容易, 心臟局部缺血耐受性強，心臟有較強的抗心律失常能力，因此食蟹猴是心肌缺血試驗理想的動物模型。然而，近年來食蟹猴心肌梗死模型的應用雖然是一種趨勢，但是中文文獻報道不多，故此，結合浙江大學附屬第二醫院蕭山動物實驗中心制備食蟹猴AMI建模的經驗，總結出其建模流程、護理方法及注意要點。

1 造模?方法

1.1 實驗動物

普通級5～6 周歲，體質量5～7 kg 雄性食蟹猴，由蘇州西山中科實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2012-0009]及廣西防城港常春生物技術開發有限公司[SCXK(桂)2013-0004]提供。

1.2 實驗條件

食蟹猴飼養在浙江大學醫學院附屬第二醫院動物實驗中心普通環境中[SYXK(浙)2014-0004]。單籠飼養, 飼養室溫度(21±3) ℃, 相對濕度55%±15%，猴維持飼料(由北京科奧協力飼料有限公司提供)一日二餐飼喂，中間一餐水果，實驗過程給予常規護理和人道主義的關懷。

1.3 主要實驗儀器與耗材

美國Cardell 公司動物專用監護儀、VME 動物麻醉機、呼吸機(Matrx 3000)、威利高頻電刀、除顫儀(Philips, Heartstart XL)、電動吸引器( 斯曼峰，Y X 9 3 0 D ) 、3 通道心電圖儀(MIDMARK?，導聯)。

1.4 造模手術前處理

1.4.1 術前準備 手術前列出清單, 逐一確認手術藥品、急救藥品、器材、耗品符合實驗的要求，打開氧氣瓶開關，確定氣壓表壓力，確認氧氣瓶中氧氣是否充足，檢查麻醉揮發罐中的異氟烷藥物是否足夠實驗的需要，檢查鈉石灰的顏色是否需要更換，檢查呼吸機氣路暢通而且無漏氣，手術臺鋪墊2 層一次性中單，整個手術室消毒液清掃后紫外燈過夜照射消毒。手術當日提前打開手術臺溫控開關，調節手術臺溫度在39～40 ℃。

1.4.2 食蟹猴麻醉 在實驗前挑選健康雄性成年食蟹猴，并稱量體質量，計算手術前誘導麻醉給藥量。并在手術前12 h 開始禁水禁食。準備手術的食蟹猴通過肌肉注射0.2 mg/kg 米達唑侖、0.04 mg/kg 硫酸阿托品注射液及5 mg/kg 鹽酸氯胺酮注射液誘導鎮靜。

1.4.3 麻醉后處理 待試驗猴進入麻醉狀態后, 對手術部位(左胸部)、電刀電極負極貼片位(背腹部)及相應的監測與皮膚接觸部位進行剃毛處理。在試驗猴小腿隱靜脈安裝留置針保留靜脈滴注通路。80 萬單位青霉素1 支溶解于100 mL 生理鹽水中, 連接靜脈通路進行滴注(保持在20滴/min左右), 同時配置2 μg/mL、5 μg/mL 腎上腺素備用。

1.5 手術造模

1.5.1 氣管插管 將食蟹猴四肢綁定在手術臺上，胸腔心臟部位正對無影燈最亮處，把2 顆上犬牙用繃帶固定在手術臺上沿，使食蟹猴頭、頸、軀干在一條直線上，用喉鏡葉片推開舌頭及托起會厭軟骨, 露出氣管入口, 根據食蟹猴體型大小選擇合適型號的氣管插管(食蟹猴一般選用型號： 3.5#、4.0#、4.5#)進行插管，插管的頂端插到食蟹猴的肩部平行的位置, 插入之前大致對照下插入深度，插到位后, 充盈插管氣囊, 用絲線類輕物放置在氣管插管口，觀察到絲線隨呼吸氣流擺動說明插管成功, 固定氣管插管, 接通氣管插管到呼吸機。

1.5.2 生命體征維持 打開氧氣瓶開關及壓力表開關，使壓力表輸出壓力保持在0.2～0.4 MPa，打開呼吸機，調節潮氣量大小10 mL/kg，呼吸頻率25～30 次/ min，調節氧氣流量計1 L/min(按照5 kg 食蟹猴)，接上心電圖電極、血壓袖帶及血氧探頭進行實時監測(圖1)。先流通一段時間氧氣，待血氧濃度正常，再打開異氟烷揮發罐開度至2%～2.5%，在手術過程中時時觀察動物生命體征(心率、血壓、血氧濃度、呼吸狀態、瞳孔反應及對痛覺的反應)，避免麻醉過度。一般在手術后程揮發罐開度調至1%即可。

圖 1 監護狀態的食蟹猴

1.5.3 AMI 手術 輔助人員接通高頻電刀，調節電刀功率電切(CUT)及電凝(COAG)功率15 W，在中單上倒入手術包、各型號線圈、一次性刀片、醫用紗布疊片、醫用棉簽。手術操作者及輔助助手穿上手術服、帽子、口罩、滅菌橡膠外科手套，利用聚維酮碘及消毒酒精對左胸部區域交替消毒與脫碘處理，食蟹猴身上再鋪1 層一次性中單，在手術部位把中單剪成圓形開口，露出手術部位，手術操作者于心臟體表左胸第4 肋處用電刀燒開皮膚層、肌肉層及肋骨肉層，露出心包，用擴胸器擴大所見心臟視野，用小剪刀小心剪開心包膜層，用帕巾鉗把心包膜與肋骨肉層夾一起，用生理鹽水浸濕的醫用疊片墊在心臟四周, 找到左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery, LAD), 用醫用棉簽固定搏動中的心臟, 在第一對角支和第二對角支之間用5-0 prolene線縫針掌握好進針深度及進針寬度連續縫合2 針，待心動周期及心電周期正常后收線打結, 以達到梗死心尖前壁及心尖心肌。術中觀察到心尖心肌變白及心電圖ST 段抬高作為成功標志(圖2、圖3)。

結束后, 用醫用紗布疊片吸凈胸腔內血水滲出物，用醫用棉簽清理盡所有心臟部位紗布疊片，復原肺及心臟在胸腔的位置后，用2-0 或3-0 縫線分別對肋骨層、肌肉層、皮膚層逐層縫合，皮膚層用棱形縫合針，其他層用圓形縫合針。關肋骨層時用氣囊膨肺，防止氣胸出現。

1.5.4 關閉胸腔后處理 關掉麻醉藥揮發罐開度,仍保持食蟹猴在插管狀態下呼吸氧氣，每只術后食蟹猴注射0.5 mL鹽酸嗎啡注射液。待食蟹猴完全清醒，生命體征(血壓、心率、血氧濃度、呼吸)平穩后歸籠，在籠中盡量側臥并且臉向籠門便于觀察。

圖 2 結扎LAD 后的心臟

圖 3 食蟹猴心梗前后Ⅱ導聯心電對比圖

2 護理

2.1 術中護理

AMI食蟹猴易發生室顫(ventricular fibrillation，VF)、心率失常及心臟驟停意外情況。電擊除顫是VF治療最有效的方法，隨VF時間的延長除顫效果急劇下降[2]，叩擊胸部，電極與皮膚間使用鹽水紗布接觸，要迅速準確地電擊除顫，除顫儀能量調至7～10 J； 反復VF 除了電擊除顫，還要合并使用腎上腺素、胺碘酮、利多卡因，小劑量開始給予，反復多次，逐漸加大劑量，直至心電恢復正常。心率失常處理： 鹽酸利多卡因注射液, 局麻藥, 常直接用在手術傷口, 主要浸潤麻醉, 1.5 mg/kg 靜脈治療AMI 后室性早博和室性心動過速； 鹽酸胺碘酮注射液，胺碘酮的藥用作用能有效降低AMI 時伴有快速心率失常的發生率，可作為AMI時發生心率失常的首選藥物，胺碘酮提高心室電穩定及異位搏動的作用, 能提高心肌的VF 閾值[3], 靜脈給予最大用量不超過30 mg。心衰處理： 呋塞米注射液20 mg靜脈給予強心利尿治療, 合并使用濃度5% NaHCO3注射液一次性推入5 mL 防止因缺氧帶來的酸中毒。心臟驟停處理：心肺復蘇(CardioPulmonary Resuscitation，CPR)同時靜脈給予0.25～0.5 mg 鹽酸腎上腺素靜脈給予。在CPR 過程中復蘇效果不佳時，要拆線開胸直接按壓心臟，盡可能不要放棄, 根據急救時間與急救效果判斷有時要果斷松開結扎點, 放棄造模, 以救活動物為主。在手術監護過程中經常測量食蟹猴血壓和心率，當血壓或心率持續下降時,要經靜脈通道給予2～5 μg/mL 的腎上腺素滴注。

2.2 術后護理

2.2.1 食蟹猴的籠前觀察 行為是食蟹猴喜怒哀樂的表達，只有通過日常細心觀察才能掌握食蟹猴健康狀況的第一手資料，如： 自我蜷縮，說明體虛畏寒；不敢對眼，害怕畏懼； 不能坐立或攀爬，匍匐籠中說明病痛不輕等等。而且，籠前觀察是食蟹猴術后護理的關鍵步驟，如攝食量、大便和小便情況、底盤中是否發現拉稀便和嘔吐物等，了解狀況及需求才能對癥護理，并記錄下這些異常行為及時與獸醫商量緩解辦法，如是否繼續給予鹽酸嗎啡用來減輕痛苦等。而且，建模后發生VF 時第一時間沒有得到急救處理，會威脅食蟹猴的生命，前期努力工作成果也將失去，而且，缺少重要的數據資料也影響實驗的進度及結果。一般在心肌梗死手術后3 d 內是食蟹猴轉危為安的適應期，度過適應期后的康復一般不會有大的生命危險。

2.2.2 體溫維持 由于麻醉藥的作用，手術中食蟹猴的心率明顯降低，機體處于放松狀態，基礎代謝處于低水平，從而導致食蟹猴低體溫現象，而且，開胸手術及心肌梗死造成心臟正常的動力提供下降，造成心射血能力的不足使供血不足，雙重作用使處于手術期的食蟹猴體溫偏低。低體溫會帶來抗傷口感染力降低、蘇醒延遲、機體缺氧導致酸中毒、也可能誘發低溫式VF、胃腸功能減退等。術后經常可觀察到食蟹猴臉色蒼白、口腔黏膜色淡、身體緊縮，行動緩慢，表情空虛、呆滯及畏寒等表現，甚至出現低體溫疾病反應。所以，術中及術后護理中必須保持食蟹猴體溫的正常水平，如在術中利用溫控手術臺設置臺面溫度高出食蟹猴正常體溫及手術臺面用雙層中單保溫；術后食蟹猴單間飼養，飼養間溫度適當高于其他飼養間(維持在25～28 ℃)，體虛的食蟹猴可以在金屬鐵絲籠上墊毛巾隔冷保溫，也可在籠前放置取暖器增暖保溫； 有時由于體虛原因可能出現嘔吐、腹瀉等癥狀，要及時清理干凈口腔及呼吸道、肛門等處，保持干凈清潔。

2.2.3 防止感染 術后前幾日每日對外科手術傷口給予聚維酮碘清創, 術后前3 d每日2次(早、晚)80 萬單位注射用青霉素鈉肌肉內注射預防感染，傷口愈合不佳或伴隨其他炎癥癥狀時，可延長1～2 d 使用青霉素鈉。對是否安裝植入子或食蟹猴是否撕拉縫合線等情況，必要時還要穿上透氣性好的防撕咬馬甲以防護傷口被破壞，傷口愈合好后(一般術后7～10 d)表皮縫合線及時拆去，以傷口白凈及干燥結痂為好，謹防紅腫、開裂及皮膚深層膿腫的存在。發現食蟹猴手術傷口開裂，應及時縫合修復完整傷口開裂處。

2.2.4 必要的營養物質補充 術后營養補充是術后康復的根本。術后食蟹猴可以開始少量進食，循序漸進加大到日標準量，每日要記錄進食量以便了解每只食蟹猴的每日飼料攝入量。在食蟹猴痛苦而不愿意飲食時，要多花心思滿足它營養物質的攝入以維持機體基礎代謝及康復的需要，這就要求管理工作人員細心觀察記錄食蟹猴的術后飲食情況。食蟹猴無進食欲望、飼料剩余量多、甚至水果也不吃的情況下，要豐富給食水果品種，要不怕麻煩少量多次給食。對完全不進食的食蟹猴要及時靜脈滴注補充營養物質，或者經口腔灌胃補充營養物質，如牛奶、糖鹽水等。

2.3 注意事項

使用鹽酸氯胺酮后食蟹猴的唾液腺分泌明顯,使用前10 min一般用抗膽堿藥如硫酸阿托品注射液肌肉內注射，以減少腺體分泌，防止分泌物反流回肺, 降低麻醉風險。在實驗過程中，如口腔出現大量唾液時, 應及時使用電動式吸引器吸盡。

心外科手術需要準備的物品較多，手術過程中出現意外情況也復雜，臨時搶救處理需要物品較急，在手術前實驗室管理工作人員要清點術中所需物品，并分類擺放，急救藥品集中放置在專用框中，放置在救護人員可見范圍之內。為方便急救給藥，在輸液器與留置針之間接上醫用輸液三通，在手術過程中除顫儀及電動吸引器隨時處于待機狀態。

手術完成后，食蟹猴不能行動前，不要拔掉氣管插管，讓食蟹猴多吸氧氣；在歸籠前，不要拔掉靜脈留置針，防止發生VF、心率失常及猝死時急救給藥需要。

3 結果

大動物基地在2014～2018年一共制作174例AMI 模型，其中3 例在AMI后出現心衰導致心臟驟停時，松開結扎點放棄繼續實驗； 4 例術中死亡； 14 例術后1 d 內死亡； 4 例術后2 d 內死亡；3例術后3 d 內死亡。

4 討論

AMI 造模是研究心肌缺血損傷公認的模型。結扎法制作的動物模型AMI 范圍較為清楚、確切、快速形成且易于復制，還可根據研究需要對心臟不同區域進行造模[4]。AMI 建模過程最為關鍵是開胸外科手術，胸外科手術操作要求手術人員與輔助人員之間密切配合，熟練造模技術人員能夠根據要求控制AMI 范圍的大小，還能夠與麻醉人員互動配合掌握術中食蟹猴的實時狀況及應對策略。

在AMI 的建模過程中，VF 是最常見的突發事件，VF 是最為危險的心率失常，電極除顫是最有效最直接的方法，及時發現VF、及時成功除顫是建模成功的另一關鍵因素。劉興利[5]利用雜種犬對LAD 實施結扎，在30 min 內3/10 的結扎犬發生了VF，并認為AMI 時，缺血心肌與非缺血心肌電生理性質的改變是VF 形成的原因。有報道[6]，小型豬LAD 結扎位點過高是AMI后發生VF 的危險因素。有研究[7]表明，早期急性心肌缺血伴隨大量的去甲腎上腺素(noradrenaline, NE)釋放與積聚，局部缺血心肌在NE 的作用下表現為VF，而且，NE 的釋放和積聚與在AMI后10～40 min 內成正向增加，隨后遞減。因此，在AMI早期階段對VF 的及時發現，及合理應對與排除是建模成功不可忽視的因素。

動物存活狀況除了與手術建模成功與否外，還與手術后的護理密切相關。建模動物由一個健康的個體，突然變成一個疾病模型，其中各種病態反應及各種相關的動物感受反應前后相差巨大,這就要求動物管理人員對建模后的動物進行各種有針對性看護與救助, AMI建模特別要注意每日的籠前觀察, 并做好記錄, 注意飲食情況、防受涼,防拉稀、防感染及必要的營養物質補充等。

該造模方法是在前降支第一對角支與第二對角支之間實施結扎，這是AMI造模常見的結扎位點。也有研究[8]認為結扎LAD 阻斷血流75 %, 模型既可以真實反應冠狀動脈疾病病變模式，而且能夠保證AMI動物的存活率，能夠有足夠的模型動物供進一步的實驗研究，模型動物是安全有效的。當然，也有模型動物回旋支及對角支供血豐富，能對前降支缺血區域及時補充血液，僅僅結扎LAD仍不能達到模型需求，可以對回旋支及對角支遠端進行結扎，結扎時參考實時心電圖及AMI 狀態。

本文是近幾年內食蟹猴AMI建模經驗，可為相關科研人員提供參考。