不同的人癌裸鼠移植瘤模型中磷脂酶A2 的表達

屠 玨, 周衛民, 蔡月琴, 凌 云, 陳民利

(1. 動物實驗研究中心/中醫藥科學院, 浙江中醫藥大學, 杭州 310053；

2. 比較醫學研究所, 浙江中醫藥大學, 杭州 310053)

惡性腫瘤一直以來是威脅人類健康和生命的重大疾病。近年研究[1,2]表明, 腫瘤細胞能破壞維持組織正常生長和功能的生化機制, 促進腫瘤微環境的形成, 腫瘤細胞和微環境之間的相互作用是腫瘤發生發展的重要影響因素, 腫瘤特殊的生理生化通路成為研究的熱點。對腫瘤細胞生化通路中酶及產物、相關信號傳導蛋白的研究有利于闡明癌癥發生的異質性, 發現新的腫瘤標志物, 探尋新的個性化治療方法。

磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)是一類具有磷脂分解活性的超家族酶類, 廣泛參與細胞內外信號的傳遞、炎癥及炎癥相關疾病等病理反應[3,4],主要分為4 大類：胞漿型PLA2(cytosolic PLA2,cPLA2)、分泌型PLA2(secretory PLA2, sPLA2)、鈣離子非依賴型PLA2(Ca2+-independent PLA2,iPLA2)和脂蛋白相關PLA2(lipoprotein-associated PLA2, lp-PLA2)。近年來大量臨床研究表明，PLA2 家族在結腸癌[5]、卵巢癌[6]、乳腺癌[7]、食管癌[8]、肺癌[9]、前列腺癌[10]等多種腫瘤組織中高表達, 而且PLA2 與腫瘤的發生、浸潤和轉移均有密切的聯系, 有望成為具有高特異性的腫瘤治療新靶點[11,12]。目前，腫瘤動物模型上有關PLA2表達的研究較少。根據2016 年統計數據顯示[13]，肺癌作為2015年我國發病率最高的惡性腫瘤，是癌癥死亡的主要原因。胃癌、食管癌、肝癌等消化系統腫瘤發病率和死亡率其次。而卵巢癌的死亡率在女性各類生殖器官惡性腫瘤中居首，是婦科腫瘤的最危險因素。因此, 本文構建了肺癌、鼻咽癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌、卵巢癌等8 種人癌細胞株裸小鼠移植瘤模型，觀察4 大類PLA2 在移植瘤模型的腫瘤組織、正常組織及荷瘤裸小鼠血清中的蛋白表達水平及表達特征，為裸小鼠移植瘤模型在PLA2 及腫瘤相關研究領域的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗動物

人非小細胞肺癌NCI-H1299 細胞、人低分化鼻咽癌CNE-2 細胞、人肝癌HepG2 細胞、人胰腺癌SW1990 細胞、人結腸癌HT-29 細胞、人胃癌SGC7901 細胞、人食管癌CaES-17細胞和人高轉移卵巢癌HO8910-PM 細胞，均購自中國科學院上海細胞庫。腫瘤細胞均用含體積分數10% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 或高糖DMEM 培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2飽和濕度的培養箱中傳代培養。

4～6周齡雌性BALB/c裸小鼠48只, 購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。每個腫瘤模型使用6 只動物，飼養及無菌實驗操作均在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障系統內進行[SYXK(浙)2013-0184]。

1.2 主要儀器與試劑

Axiovert 200 熒光倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司, Forma 3111 型細胞培養箱、1300 生物安全柜均購自美國Thermo 公司, RPMI 1640、DMEM高糖培養基、青-鏈霉素、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司，cPLA2、sPLA2、iPLA2、lp-PLA2 酶聯免疫試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 取對數生長期細胞，經質量分數0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養基配成單個細胞懸液，以臺盼藍拒染法計數后，將細胞懸液濃度調整為(2.5～5)×107個/mL，每鼠頸背皮下接種0.2 mL。細胞懸液放置于冰上，接種過程必須在細胞懸液制備后1 h 內完成。

1.3.2 ELISA檢測PLA2表達 移植瘤模型待腫瘤生長至瘤體積達1 cm3后，小鼠頜下靜脈取血，分離血清，處死小鼠，剝取瘤組織，選取距離腫瘤組織3 cm外的肩胛骨位置的肌肉組織作為正常組織。采用ELISA 法檢測腫瘤組織、正常組織及血清中PLA2 的蛋白表達。同時取正常裸小鼠血清做平行對照。方法簡述如下： 按照ELISA試劑盒說明書，向剪碎的腫瘤組織、正常組織中加入冷PBS 充分勻漿，3 500 r/min 離心15 min取上清液。將標準品稀釋成系列濃度后各50 μL依次加入, 待測樣品孔分別加入待測腫瘤組織、正常組織上清液和血清各10 μL, 再加樣本稀釋液40 μL。標準品孔和樣品孔每孔加入酶標抗體100 μL, 充分混勻, 37 ℃溫育60 min； 洗滌后每孔加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，酶標儀450 nm 波長下檢測吸光度(A)值。以標準品的A 值繪制標準曲線，根據標準曲線公式計算樣品cPLA2、sPLA2、iPLA2 和lp-PLA2 的含量。

2 結果

2.1 不同移植瘤模型中腫瘤組織PLA2 蛋白表達

2.1.1 腫瘤組織cPLA2 的蛋白表達 8 種不同的裸小鼠移植瘤模型中，cPLA2 在腫瘤組織中的蛋白表達均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖1)。

2.1.2 腫瘤組織sPLA2 的蛋白表達 8 種不同的裸小鼠移植瘤模型中，sPLA2 在腫瘤組織中的蛋白表達均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖2)。

2.1.3 腫瘤組織iPLA2 的蛋白表達 NCI-H1299、CNE-2、HepG2、SW1990、SGC-7901、CaES-17和HO-8910PM小鼠移植瘤模型中, 腫瘤組織iPLA2的蛋白表達均極顯著高于正常組織(P＜0.01)，而人結直腸癌細胞HT-29 移植瘤模型中，腫瘤組織iPLA2的蛋白表達與正常組織相比差異無統計學意義(P＞0.05)(圖3)。

2.1.4 腫瘤組織lp-PLA2 的蛋白表達 HT-29 移植瘤組織lp-PLA2 蛋白表達顯著高于正常組織(P＜0.05), 其余7 種小鼠移植瘤模型中，腫瘤組織lp-PLA2的蛋白表達均極顯著高于正常組織(P＜0.01)(圖4)。

與正常組織比較, **P＜0.01圖 1 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織cPLA2 的蛋白表達

與正常組織比較, **P＜0.01圖 2 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織sPLA2 的蛋白表達

與正常組織比較, **P＜0.01圖 3 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織iPLA2 的蛋白表達

與正常組織比較, *P＜0.05； **P＜0.01圖 4 裸小鼠移植瘤模型中腫瘤組織和正常組織lp-PLA2 的蛋白表達

表 1 裸小鼠血清中PLA2 的蛋白含量

2.2 血清中PLA2 的蛋白含量

結果顯示，8 種不同的移植瘤模型中，荷瘤裸小鼠血清中4種類型PLA2的蛋白含量均極顯著高于正常血清(P＜0.01)(表1)。

3 討論

研究表明[4]，PLA2超家族酶類主要通過催化細胞膜的甘油磷酸脂二(sn-2)位酰基水解，產生以花生四烯酸(arachidonic acid, AA)為主的游離脂肪酸及溶血磷脂。這些脂類是細胞內生理生化通路的重要底物, 可進一步通過自分泌或旁分泌產生PG E2、白三烯(leukort iene, LT)和血栓素(thromboxane, TX)等具有生物學活性的分子。這些活性分子具有調節細胞增殖、存活、分化、運動，組織血管分布和幾乎所有組織的免疫監督，而機體的這些正常功能在腫瘤發生和轉移的時候均會被腫瘤細胞所逆轉。因此, PLA2 通路與癌癥的發生、發展之間的關系越來越受到研究者的關注。統計數據顯示[13], 肺癌仍是我國發病率最高的惡性腫瘤，環境污染導致的空氣質量日趨惡化，肺癌發病率每年都在升高。同樣，在我國鼻咽癌已經成為呼吸系統的高發腫瘤和主要病死因素, 預后相對較差, 生存率相對較低。其病因可能與遺傳、環境和EB 病毒感染等有關。隨著我國人口老齡化不斷加重，鼻咽癌的發病率和死亡率可能還將不斷上升[14]。同時數據顯示[15]，我國死亡率最高的癌癥依次分別是： 肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、結直腸癌，約占所有癌癥死亡人數的3/4，除了肺癌其他4種均為消化系統惡性腫瘤。并且，不良生活習慣、幽門螺旋桿菌等的感染使消化系統腫瘤的發病率一直居高不下。近年來，生活壓力、環境等原因導致女性生殖系統惡性腫瘤的發病率持續升高，其中卵巢上皮癌是女性生殖器官惡性腫瘤中死亡率最高的[16]。因此，研究呼吸、消化和生殖系統腫瘤動物模型中PLA2的表達特征對PLA2與腫瘤的相關性研究具有重要的參考價值。

已知，哺乳動物基因組編碼超過30 種PLA2或相關酶，主要包括cPLA2、sPLA2、iPLA2 和lp-PLA2 四大類。其中，cPLA2 共有6 個胞內酶，在結腸、小腸及肺癌組織中觀察到cPLA2 高表達，同時在這些組織中檢測到高表達的COX-2、LOX-2、AA 和PGE2 等。我們利用人癌細胞株接種裸小鼠誘發的呼吸系統(肺癌、鼻咽癌)、消化系統(肝癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌)、生殖系統(卵巢癌)的不同移植瘤模型的腫瘤組織和血清中，均觀察到cPLA2 高表達，且極顯著高于正常組織和正常血清。現已有研究[17,18]證實，cPLA2 通過促進結腸組織PGE2 的產生, 與受體EP2 相互作用促進結腸癌的發展。也有研究表明前列腺癌中cPLA2 的作用是激活sPLA2[19]。

sPLA2是最早發現也是PLA2超家族最大的一個分支。sPLA2 的表達和活性在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和皮膚癌腫瘤組織中均顯著升高[20], 并且能通過水解磷脂產生類花生酸類物質,調控非小細胞肺癌(NSCLC)的發展[21]。可見，PLA2家族各類型酶還能通過相互作用共同參與腫瘤的發生發展。在本文構建的裸小鼠移植瘤模型中，處于對數生長期的腫瘤組織中的sPLA2 表達水平極顯著高于正常組織, 且荷瘤裸小鼠血清中sPLA2 的表達水平亦極顯著高于正常裸小鼠, 與cPLA2 表達特征一致。有研究者[22]還發現, 胃癌、腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、肺癌等病人血清中sPLA2顯著高于健康個體, 并伴隨C反應蛋白(CRP)和凝血因子的顯著升高，提示sPLA2 可能通過激活炎癥信號參與腫瘤發生發展。

同樣，多項實驗研究[23,24]表明，iPLA2 參與Caspase-3 信號通路，通過啟動下游事件包括PGE2 的產生，誘導炎癥反應，促進化療、放療過程中存活的腫瘤細胞增殖，在腫瘤治療過程中發揮重要的調控作用。而主要由成熟巨噬細胞和淋巴細胞合成和分泌的lp-PLA2一直被認為是心血管疾病的炎癥標志物，研究表明其對腫瘤細胞凋亡、增殖、運動、粘附等均有影響。近來有研究發現[25]，鼻咽癌細胞能誘導巨噬細胞分泌lp-PLA2，促進腫瘤細胞遷移。因此，炎癥是PLA2參與腫瘤發生發展的可能機制之一。另有研究表明，lp-PLA2 的底物——血小板活化因子(PAF)有抗腫瘤生成的作用，因此lp-PLA2 可能通過酶解PAF 促進腫瘤生成[26]。已有研究報道了癌癥病人腫瘤組織和血清中lp-PLA2活性[27]和mRNA水平的升高[28]。本文在裸小鼠移植瘤中同樣觀察到iPLA2、lp-PLA2 在腫瘤組織和血清中的高表達。

此外, 公共數據庫對不同的腫瘤組織、正常組織和細胞中的蛋白表達分析結果表明[29]，cPLA2、sPLA2 和iPLA2 在多種癌癥的腫瘤組織中均顯示高表達，顯著高于正常組織。該特點沒有腫瘤類型的特異性。這在本文構建的8 種不同癌癥的裸小鼠移植瘤模型中得到了較好的驗證。此外，分析數據庫結果發現，iPLA2 在17 種癌癥的腫瘤組織中均有表達且表達量差異不明顯。cPLA2α在肺癌和子宮內膜癌中的表達量明顯高于其他癌癥。sPLA2 在前列腺癌中的表達最高，在其余類別的癌癥中表達量相當。而本文構建的8種小鼠移植瘤模型由于選取的癌癥類型有限、選擇的腫瘤細胞株比較單一，也未對不同性別、不同生長階段的腫瘤模型進行研究，難以反應不同癌癥之間的表達差異，是本文欠缺的地方，有待在今后研究中不斷完善和深入。

綜上所述，PLA2 在裸小鼠移植瘤模型的腫瘤組織和血清中均呈現高表達，無腫瘤類型特異性，具備癌癥臨床上PLA2 的表達特點[22]。本文研究結果為在人癌裸小鼠異種移植瘤模型中研究PLA2 與腫瘤的相關性提供理論基礎和實驗依據。