不同濃度弗氏佐劑對B6AF1 小鼠免疫性卵巢早衰模型建立的影響

陳 玥, 王佩娟, 陳 思, 盧 燕

(南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院婦產科, 南京 210028)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指40歲之前由于卵巢內卵泡耗竭或破壞而發生卵巢功能衰竭的一種綜合征。POF 的發病率： 20 歲以前約為0.01%, 30 歲前約0.1%, 40 歲前約1%[1]，超過半數的本病患者具有不良情緒甚至抑郁、厭世[2]，嚴重影響女性身心健康，造成社會負擔。發病率的逐年升高及病患年輕化的現狀，與生育年齡的整體延后和社會對精神心理健康關注形成強烈矛盾。本病的致病因素包括：遺傳因素、感染因素、自身免疫因素、醫源性損傷及精神因素等[3]，約1/3 的POF 的發病與自身免疫異常密切相關。然而迄今為止，有關POF 的免疫學機制研究進展十分緩慢，究其原因之一是缺乏用于開展各項藥物實驗的標準化動物模型。本研究根據近幾年國內外POF相關動物模型研究進展，選取(C57BL/6 × A/J) F1(B6AF1)雌鼠作為研究對象，將透明帶3 多肽(pZP3) 抗原分別與不同佐劑混合免疫小鼠, 觀察其免疫效果, 以期建立免疫性POF動物模型，進一步探究POF 的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性 A/J 小鼠10 只，雌性C57BL/6小鼠30 只，均為7～9 周齡，購自中國人民解放軍軍事醫學研究院實驗動物中心[SCXK-(軍)2007-004]，于江蘇省中醫藥研究院屏障設施飼養并繁殖B6AF1 小鼠[(C57BL/6×A/J) F1]。本實驗取6～8 周齡B6AF1 雌鼠80 只分為：空白組、不完全弗氏佐劑(IFA)組、完全弗氏佐劑(CFA)[含結核分枝桿菌(TB)1 mg/mL] 組和IFA+ TB(3.3 mg/mL)組，每組20 只。體質量21～23 g，自由攝食飲水，每日保持12 h 明暗交替，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～50%[SYXK(蘇)2016-0018]。

1.2 實驗試劑

透明帶3(ZP3)330～342 氨基酸系列的多肽片斷[pZP3，ZP3330-342(NSSSSQFQIHGPR)]，分析純度＞95%，購自上海吉爾生化有限公司。IFA(#344291)、CFA(#344289)購自美國Sigma 公司，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, #231141) 購自美國BD Difco 公司。

1.3 實驗處理與分組

采用雙蒸水將pZP3 配制成為1 mmol/mL的溶液。與1.1 對應的3 組分別選取 IFA、含1 mg/mL的TB H37Ra 的CFA、 經配制含有3.3 mg/mL 的TB H37Ra 的CFA與pZP3 溶液按等比例混合配成免疫乳化劑，用0.1 mL 乳化劑注射腳掌和尾根皮下免疫小鼠，第14 日加強免疫1 次。空白組選擇生理鹽水。

1.4 取材與卵巢HE 染色

自第1 次免疫后28 d 處死小鼠，取小鼠卵巢組織HE 染色： 將卵巢放入Bouin 氏固定液，24 h后脫水包埋，常規石蠟切片5 μm，進行HE 染色。病理切片在倒置顯微鏡下進行拍照觀察。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

免疫各組B6AF1小鼠均出現了體質量明顯下降，精神萎靡不振、反應遲鈍和行動遲緩。

2.2 小鼠動情周期的改變

免疫后各組小鼠出現不同程度的動情周期紊亂, 表現為動情周期縮短、延長和持續動情周期，與空白組相比差異有統計學意義(P＜0.05)(表1)。

2.3 卵巢組織病理學觀察

空白組卵泡數量較多，發育較好，有成熟卵泡，各級卵泡均有，卵泡形態規則，顆粒細胞排列整齊(圖1A)； IFA 組見少量卵泡，卵泡形態尚規則，顆粒細胞排列較紊亂，有一個次級卵泡(圖1B)； CFA 組見大量初級卵泡，卵泡形態尚規則，顆粒細胞排列紊亂(圖1C)； IFA+TB 組見少量卵泡，未見次級卵泡及成熟卵泡，卵泡形態不規則，顆粒細胞排列紊亂，可見淋巴細胞及漿細胞浸潤(圖1D)。說明不同濃度佐劑免疫后均導致小鼠POF 模型，高濃度組免疫效果最好。

3 討論

Rhim 等[4]在1992 年報道pZP3 可誘導小鼠產生抗ZP3 抗體, 與卵巢ZP3 結合引起免疫反應, 從而引起類似于人類POF 的表現如儲備卵泡減少、卵巢體積萎縮等。不同種系小鼠在免疫反應性方面存在顯著差異, 相同劑量pZP3 可引起B6AF1、BALB/c 小鼠自身免疫性卵巢炎，之后陸續有學者[5-7]選用BALB/c 小鼠造模成功。本研究選用成模率較高的B6AF1 雌鼠作為研究對象[8], 用弗氏佐劑聯合pZP3 多肽造模，具有操作簡單、成模率高和死亡率低等優點。結果提示, 與空白組比較,模型組小鼠的動情周期紊亂，卵巢萎縮，卵巢組織病理表現提示為自身免疫性卵巢炎, 且卵巢組織內淋巴細胞大量浸潤, 符合免疫性POF 的特點[9]。

佐劑本身不具備免疫原性, 與抗原物質一起注射或預先注入機體后，起到免疫增強的作用，使機體更早、更有效、更持久地產生免疫應答[10]，佐劑與抗原合用時能顯著增強抗原免疫效應[11]。其可能的作用機制有二：一是與局部淋巴細胞接觸可濃縮抗原, 即儲存效應(depot effect)； 二是通過誘導細胞因子的產生，調節淋巴細胞的功能。

表 1 不同組別小鼠動情周期的改變Table 1 Change of estrous cycle in the four groups

A： 空白組； B： IFA 組； C： CFA 組； D： IFA+TB 組圖 1 小鼠模型卵巢病理圖(HE ×100)

佐劑與抗原混合后形成“油包水”乳膠混合體, 這種抗原佐劑混合物的優點在于： 一方面，抗原被乳劑包裹后可在注射部位緩慢釋放，能夠非常有效地誘導產生高滴度的抗體；另一方面，油滴中免疫原的持續釋放加強佐劑活性，刺激局部免疫反應。目前動物實驗中常用的有弗氏佐劑、卡介苗、脂質體和類病毒顆粒等。弗氏佐劑分為CFA 和 IFA 兩種，區別是前者含有TB 成分。CFA 所含的TB 的細胞壁成分可以加強機體對抗原的抗體反應。雖然有報道[12]其可引起注射局部皮膚潰瘍等反應。且有致敏以及潛在的致癌作用等毒副作用，但其高度佐劑活性是其它物質難以媲美的。

綜上所述，弗氏佐劑聯合pZP3 誘導B6AF1小鼠可以成功構建免疫性POF模型，同時引起卵巢組織局部淋巴細胞大量浸潤導致免疫性卵巢炎，含高濃度TB 的試劑造模效果更好。