VEGF 基因沉默對人肺癌A549 細胞放射增敏作用的體內研究

馬 軍, 羅居東, 景文江, 張淑蓮, 王娟毅, 范志剛

(1. 漢中三二〇一醫院腫瘤科, 漢中 723000；

2. 南京醫科大學附屬常州第二人民醫院腫瘤中心, 常州 213164)

作為腫瘤治療的主要手段，放射治療廣泛應用于多種腫瘤[1]。肺癌是死亡率增長最快的惡性腫瘤，它的發病率也一直在全世界占據首位[2～4]，肺腺癌屬于非小細胞肺癌，約占所有肺癌的80%,約75%的患者在確診時已處于中晚期，5 年生存率很低[5～8]。惡性腫瘤對射線的敏感性不高，即使接受高劑量射線，仍不能得到理想效果[9]。因此如何提高其放射敏感性成為重要研究課題。

目前，基因沉默結合放射治療已成為腫瘤治療的新趨勢[10]。在鼻咽癌、結腸癌、皮膚鱗狀細胞癌等腫瘤中, 關于通過干擾沉默血管內皮生長因子(VEGF)基因來治療的研究已經有報道[11-13]。干擾VEGF 基因的方式在多種腫瘤中呈現明顯的抑制作用[14-17]。然而，關于siVEGF 對肺癌細胞放射敏感性的影響尚未報道。本研究通過建立A549荷瘤鼠模型, 利用體內沉默VEGF基因的技術手段, 驗證siVEGF對放射治療非小細胞性肺癌敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器設備

5周齡雌性BALB/C-nu裸小鼠, 體質量17～18 g,購自廣州中醫藥大學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0034]。A549細胞系購自ATCC, PCMV-VEGF siRNA 沉默質粒由上海吉瑪制藥技術公司設計構建，RNAi-MateTM轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術公司, VEGF、β-actin 抗體購自Santa Crus 公司,q-PCR儀器采用美國ABI公司 7900HT型PCR儀。

1.2 方法

1 .2.1 細胞培養 人肺腺癌A549細胞株培養于含有10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素(100 IU/mL)的RPMl 1640 培養基。7 ℃、體積分數5% CO2培養箱中進行細胞培養，當細胞生長融合度為七八成時候進行細胞傳代。細胞實驗選用正處于對數生長期細胞。

1.2.2 小鼠腫瘤模型的建立 胰酶消化對數生長的A549 細胞, 完全培養基終止消化。收集細胞并用無菌預冷的PBS 清洗2 次。細胞計數并且用PBS 重懸, 調整細胞的濃度為1×107/mL。200 μL均勻的細胞懸液注射于裸小鼠左后背部皮下。40 只裸小鼠共分為4 組，空白質粒對照組、放療組、VEGF 基因沉默組、VEGF 基因沉默+放療組，每組10 只。以皮下結節長徑超過0.5 cm為成瘤標準。接種當日為1 d，接種7 d 后達到成瘤標準，即為荷瘤小鼠，用于實驗。

1.2.3 目標基因序列的選擇及siRNA序列設計 目標基因靶序列是按照siRNA 設計原則，在基因編碼區進行選擇。然后設計特異性干擾序列，寧合成VEGF siRNA 正、反義寡核普酸鏈。無意義序列的干擾序列作為實驗對照(siMock)(表1)。

表 1 siVEGF 基因序列Table 1 The gene sequence of siVEGF

1.2.4 體內質粒轉染 將荷瘤鼠隨機分為4組： 空白對照組(siMock)； 單純siVEGF 組； 單純放療組；siVEGF 加放療組。將10 μg siVEGF 及siMock 質粒分別與30 μg RNAi-MateTM轉染試劑于150 μL無血清的1640培養基混勻待用。采用瘤內局部多點注射法, 每次150 μL/只，7 d 重復注射一次, 共3 次。對照組和單純放療組注射siMock/RNAi-MateTM混合物； 單純siVEGF組和siVEGF加放療組注射siVEGF/RNAi-MateTM混合物，各放療組分別在最后一次給藥后2 d 進行照射。

1.2.5 放療條件 首先將裸小鼠固定, 使用鉛板對裸小鼠的除腫瘤外的其他部位進行防護。用美國VARIAN 2300C/D型雙光子直線加速器(300 cGy/min,4 Gy)局部照射腫瘤。

1.2.6 動物模型測量及HE 染色 按照動物飼養規定和動物倫理按規飼養裸小鼠。每日測量裸小鼠腫瘤大小(長徑和短徑)并計算腫瘤體積，檢測腫瘤的生長。腫瘤體積計算公式為V=0.5 a×b2(a 是長徑，b 是短徑)。放射治療當日為實驗1 d，經放射治療后，即實驗24 d 給裸小鼠施行安死術，收集各組裸小鼠完整腫瘤組織用于后續實驗。其中，部分組織固定后，石蠟包埋，常規切片，伊紅、蘇木素進行H E 染色。

1.2.7 Q-PCR 檢測轉染后VEGF 的mRNA 表達收集腫瘤組織，T r i z o l 對組織進行裂解提取RNA。1 μg 總RNA 用于逆轉錄成cDNA，再以cDNA 為模板，采用Taq PCR MasterMIx 試劑進行PCR 擴增反應。VEGF 的上游引物序列為： 5'-TGCCTAG-ATCTCTCCAGAGAT-3', 下游引物序列為： 5'-TCG-TGCATATGTGCTTCTAC-3', 擴增長度為322 bp。PCR 擴增反應條件如下： 98 ℃變性10 s、56 ℃退火30 s 和72 ℃延伸35 s, 循環30 次；再72℃延伸10 min。實時定量 PCR 的結果采用2-△△Ct法進行計算, 用內參基因β-actin對各基因表達水平均一化, 2-△△Ct法計算公式： △Ct = Ct目的基因- Ct內參基因，△△Ct = △Ct實驗組- △Ct對照組。每組實驗至少重復3 次。

1.2.8 Western blotting 檢測轉染后VEGF的蛋白表達 各組腫瘤組織剪碎并用組織裂解液裂解，Bradford 法測量蛋白質濃度。取各樣本20 μg 的蛋白勻漿液進行SDS-PAGE 電泳，濕轉將蛋白轉移至PVDF 膜，5% BSA 封閉后，分別加入兔抗鼠多克隆一抗VEGF (1∶1 000)，4 ℃，12 h。回收一抗并洗膜，HRP 標記的二抗孵育1 h，用ECL 發光法檢測蛋白條帶，以β-actin作為內參進行標準對照。每組實驗至少重復3 次。1.2.9 免疫組織化學檢測轉染后VEGF 的蛋白表達 取各組腫瘤組織, 質量分數4%多聚甲醛溶液中固定, 蔗糖梯度脫水24 h, 常規石蠟切片, 脫蠟后, 在枸櫞酸鈉緩沖溶液中進行高壓抗原修復, 3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶后, 正常血清封閉，4℃孵育在含有VEGF(1∶200)抗體工作液12 h。之后使用生物素標記的二抗和HRP標記鏈霉卵白素工作液，孵育30 min 后。之后經過清洗, 顯色,復染和封閉后進行觀察。原始實驗數據的判讀方式： 判讀的胞核、胞漿染色的染色強度(0/1+/2+/3+)和染色陽性率。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0 軟件進行數據統計分析，各組數據采用t 檢驗，免疫組織化學評分數據采用秩和檢驗，計量數據用x-± s 表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siVEGF合并放療對腫瘤生長的影響

裸小鼠荷瘤生長曲線結果顯示： 裸小鼠皮下移植A549 細胞后，隨著時間的延長，各組腫瘤體積都增加, 相對于對照組, siVEGF單獨組和放療單獨組的腫瘤生長均有被抑制趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。但是siVEGF與放療聯合治療組的腫瘤生長卻被明顯抑制, 至20～24 d差異更明顯(P＜0.01)(圖1A)，而各組體質量相差不大(圖1B),裸小鼠大體及皮下瘤組織照片見圖1C。

2.2 RT-PCR和Western blotting 分別檢測VEGF的mRNA 和蛋白的表達

處死質粒轉染后的荷瘤鼠，取腫瘤組織，組織勻漿后，分別做RT-PCR 和Western blotting。結果表明：siVEGF 組相對于siRNA-Mock 組，VEGF mRNA 水平和蛋白水平有明顯下降，P＜0.05，說明質粒體內轉染成功(如圖2)。

2.3 免疫組織化學檢測VEGF的表達

VEGF 的免疫組織化學檢測表明, 與siMock組相比, siVEGF轉染組以及合并放療組, VEGF表達明顯降低, 即棕色顆粒顯色程度明顯降低(P＜0.05)；而單獨放療組，VEGF 的下降并不明顯。這進一步表明s i V E G F 質粒轉染成功，同時，可見siVEGF 合并放療組腫瘤壞死組織增加(圖3)。

A： Q-PCR 驗證VEGF 的mRNA 水平變化； B： Western blotting 驗證VEGF 的蛋白水平變化； 與對照組比較, #P＜0.01圖 2 siVEGF 體內轉染成功Figure 2 siVEGF was successfully transfected in vivo

A： 質粒轉染對照組； B： 單純放療組； C： siVEGF轉染組； D： siVEGF轉染加放療組； Bar=20 μm圖 3 免疫組織化學檢測VEGF 的蛋白表達Figure 3 Immunohistociemical staining detect tie expression of VEGF protein

2.4 siVEGF 合并放療對腫瘤壞死面積的影響

通過鏡下測量各個腫瘤壞死區域長徑和短徑用以估算腫瘤壞死面積。對腫瘤壞死面積的分析表明，與對照組比較, 單純siVEGF 轉染組腫瘤壞死面積增加不明顯, 單純放射組腫瘤壞死面積明顯增加(P＜0.05), 說明放療有效果。而siVEGF 聯合放射組顯著增加了腫瘤壞死面積(P＜0.01)(圖4A)。HE 染色顯示，壞死樣組織細胞縮小，碎裂，細胞凋亡明顯(圖4B)。

3 討論

作為最常見的高發病率、高死亡率的一種癌癥，全球每年大約有150 萬人被診斷為肺癌[1]。癌癥的發病率高復發和轉移是肺癌治療失敗的兩個主要原因。對晚期或轉移性肺癌患者進行局部放療和化療是通常的治療方法。腫瘤的發生和發展是一個逐漸演化的多因素協同作用的長期過程，其中腫瘤的血管生成對于肺癌的生長和轉移起到關鍵作用。因而，靶向腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤發展的思路顯得尤為重要。

VEGF 是一種活性很強的血管發生和血管生成生成生長因子，與腫瘤的生長、轉移和預后密切相關。多種腫瘤中VEGF 的水平與患者5 年存活呈負相關的關系； 多種組織類型的腫瘤細胞分泌VEGF, 通過旁泌生長刺激來引發內皮細胞增殖及血管形成, 促進腫瘤的增殖[18]。在腫瘤放療過程中, VEGF 對輻射后血管再生起著重要的作用[19]。另外，VEGF可以協同抗凋亡蛋白Bcl-2抑制內皮細胞凋亡, 促進血管生成，進而產生放射治療的抵抗[20]。研究[21]表明腫瘤微環境中，缺氧能夠明顯誘導VEGF 的產生，而且，腫瘤在放療過程中進一步增強了微環境的乏氧程度，促進了VEGF的分泌，進而促進了血管生成和腫瘤細胞對放療射線的抵抗。正是因為VEGF 在腫瘤的發生發展以及放射敏感性的重要作用，VEGF 的靶向與腫瘤放療聯合療法表現出誘人的治療前景。

A： 腫瘤壞死面積的定量分析, 與對照組比較, *P＜0.05, #P＜0.01；B： H&E 染色, 1～4 分別為對照組、siVEGF 轉染組、放療組和siVEGF 轉染加放療組圖 4 siVEGF 合并放療增加腫瘤壞死面積Figure 4 siVEGF transfected and radiotherapy increase the necrotic area of tumor

非小細胞性肺癌惡性程度高，一般發現較晚，放療是其重要治療手段之一。如何增加腫瘤細胞的放射敏感性一直是放療研究的熱點和重點。作為一種轉錄后調控的方式，RNA 干擾通過與目的基因同源的小干擾RNA在靶細胞內形成誘導沉默復合體, 選擇性降解目標基因mRNA, 進而有效降低目的基因的表達[22]。siRNA 在基因沉默過程中具有特異性、精準性和高效性優點[23]。因此通過沉默VEGF 基因，降低腫瘤細胞VEGF基因的表達，增強腫瘤細胞的內在放射敏感性是一種新的增敏方式。在肺癌中沉默VEGF，可以起到抗腫瘤血管生成的作用[24,25]，同時沉默VEGF 可以增強鼻咽癌CNE-2 細胞對放射的敏感性[26], 同時, 抑制VEGF 可以增強光動力學療法對頭頸部腫瘤的治療[27]。

本研究利用 RNA 干擾技術，沉默肺癌細胞中 VEGF 的表達, 并且成功地建立了A549裸小鼠荷瘤模型, 實驗表明，siVEGF 能抑制體內腫瘤的生長, 而且沒有觀察到明顯的毒副作用。siVEGF聯合放療組腫瘤生長明顯抑制，且腫瘤組織有較多的壞死。Q-PCR、Western blotting、免疫組織化學檢測表明, siVEGF 及siVEGF 配合放療組，VEGF 的表達明顯減弱。實驗表明瘤內注射脂質體包裹的siVEGF 對A549 細胞有放射增敏作用，為臨床開展針對VEGF 基因的靶向治療和放射治療的聯合治療非小細胞性肺癌提供了實驗依據。