樹鼩大腦皮層少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的分離鑒定

李明學(xué), 黎曉慧, 黃 鑫, 王 璇, 張志成, 袁 園, 陸彩霞, 孫曉梅

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

樹鼩種質(zhì)資源中心, 昆明 650118； 2. 昆明醫(yī)科大學(xué), 昆明650500)

少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes, OLs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)髓鞘形成的唯一細(xì)胞, 起源于胚胎神經(jīng)管腹側(cè)的神經(jīng)上皮細(xì)胞[1]。其主要功能是產(chǎn)生髓鞘包繞神經(jīng)軸突，維持神經(jīng)沖動沿軸突跳躍性傳導(dǎo)。另外它還能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育與存活[2]。OLs 在發(fā)育過程中, 大致經(jīng)歷了少突膠質(zhì)祖細(xì)胞、 少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(immature oligodendrocyte)和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(mature oligodendrocyte)幾個階段[3]，其形態(tài)、功能和表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)連續(xù)漸變過程，各發(fā)育階段沒有嚴(yán)格界限之分。越來越多研究表明,OLs 異常在CNS 脫髓鞘病變[4]、神經(jīng)元損傷[5]、精神疾病等的發(fā)病機制中起著重要作用[6-8]。有研究者[9]曾嘗試將體外培養(yǎng)成熟的OLs 移植入髓鞘，對脫髓鞘病變的CNS 進(jìn)行細(xì)胞治療。但是，成熟的OLs 缺乏增殖和遷移能力，移植后并不能使病變受損部位形成具有正常功能的髓鞘。已有研究[10]證明，體外培養(yǎng)的OPCs 在一定的條件下可定向分化成為成熟的OLs，將體外培養(yǎng)OPCs移植入體內(nèi)并誘導(dǎo)其分化為成熟的OLs 形成具有正常功能的髓鞘。那么, OPCs 將有可能成為治療CNS 疾病或者損傷的理想細(xì)胞。所以，高純度、高質(zhì)量OPCs 的體外培養(yǎng)是該研究工作的基礎(chǔ)。

樹鼩是一種新型的實驗動物，其生理、生化、解剖結(jié)構(gòu)以及基因組等生物學(xué)特性比嚙齒類更接近于非人靈長類，且大腦較發(fā)達(dá)，已被用于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究[11-13]。目前，國內(nèi)外對大鼠、小鼠OPCs 的培養(yǎng)報道[3-9、14-16]很多，有關(guān)樹鼩OPCs 的培養(yǎng)方法及研究尚無報道。本文探索樹鼩OPCs 的培養(yǎng)及鑒定方法，為利用樹鼩開展相關(guān)研究提供新的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生48 h內(nèi)的樹鼩，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK(滇)K2018-0002]； 實驗操作在本中心實驗設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(滇)K2018-0001]，并遵循實驗動物使用的3R 和福利倫理原則。

1.2 儀器與試劑

Forma A/B3(6Ft) 生物安全柜(美國，F(xiàn)orma)；CO2T/C 恒溫培養(yǎng)箱(美國，Thermo)； ECLIPSE Ti 倒置顯微鏡(日本，Nikon)； L8-80M 超速離心機(德國，Hermle)； ZD-85 數(shù)顯恒溫振蕩器(中國)：TOMY-SS-325 高壓滅菌鍋(日本, Tomy)； PBS(美國, Hyclone，SH30256.01B)； DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國, Sigma, D8437)； FBS(Israel, BI, 04-001-1A)；胰蛋白酶(美國，Gibco)； D-Hank’s 液(美國，索萊寶，H1040)； DNase Ⅰ(德國，Applichem，D3778.0050)； Poly-D-lysine(美國，Sigma)； BSA(中國，Biosharp)； Anti-Myelin Basic Protein Antibody(髓鞘堿性蛋白, MBP； 美國, Sigma, M3821-100UG)；Anti-NG2 Antibody(硫酸軟骨素蛋白多糖4，NG2,英國, Abcam, ab183929)； 人睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF； 美國, Cyagen, HEOPP-0301)； 三碘甲狀原氨酸(T3； 德國, Millipore, 642511-10MG)； Human FGF-base (bFGF； 美國, PeproTech, 100-18B-50)；B-27 Supplement(50X)(美國, Invitrogen, 17504044)；Cy3 標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗(德國，Millipore，AP182C)； 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI； 美國，Sigma)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液

混合培養(yǎng)液： DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗；增殖培養(yǎng)液： DMEM/F12+10 ng/mL bFGF+1%FBS+2%B27+5 μg/mL 胰島素+1% 雙抗；分離液：DMEM/F12+0.02%EDTA+0.5%DNase I+5 μg/mL胰島素+1%雙抗； 分化培養(yǎng)液： DMEM/F12+30 ng/mL T3+10 ng/mL CNTF+2%B27+5 μg/mL 胰島素+1%雙抗。

1.4 方法

1.4.1 OPCs 分離 取新生48 h 內(nèi)的樹鼩, 實施安死術(shù)后在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡15 s，取出后用PBS 沖洗兩遍去乙醇。用眼科剪剪去頭皮，鑷子掀去頭骨, 彎鑷小心取出大腦, 置于裝有D-Hanks液(4 ℃預(yù)冷)的無菌培養(yǎng)皿中，洗滌2 遍，去除血跡。用鑷子從大腦腹側(cè)及邊緣小心地撕去腦膜和血管，去除腦干和小腦，夾取大腦皮層移入另一個裝有D-Hanks液的無菌培養(yǎng)皿中洗滌1次，以上都在冰板上操作。將大腦皮層移入一無菌小瓶中，用眼科剪盡量將大腦皮層剪碎成模糊狀，加入3 mL 0.25%胰酶和1 mL DNase I 消化，再用吸管吹打，制成細(xì)胞混懸液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5～10 min。加入混合培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打混勻, 吸取細(xì)胞混懸液放入70 目細(xì)胞篩網(wǎng)中過濾一次, 使之分散成單個細(xì)胞。收集到15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心10 min，棄去上清，留沉淀，加入混合培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液接種于普通25 cm2的培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，輕輕吸出細(xì)胞懸液(以去除已貼壁的成纖維細(xì)胞和較大的組織碎片)接種于預(yù)先用PDL 處理過的25 cm2的一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 OPCs增殖培養(yǎng)與純化 原代混合細(xì)胞培養(yǎng)5 d 后，加入增殖液培養(yǎng), 每日換液。2 d 后, 去除增殖培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次, 加入分離液, 放入培養(yǎng)箱孵育10～15min。用吸管吸取培養(yǎng)液, 輕輕吹打細(xì)胞培養(yǎng)面，而后吸取細(xì)胞混懸液放入40目細(xì)胞篩網(wǎng)中過濾一次, 1 000 r/min 離心10 min，棄上清，留沉淀，加入混合培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液接種于未處理過的6孔板中, 放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。之后輕輕地吸取上清到PDL處理過的6孔板中培養(yǎng)1 min。最后輕輕吸出細(xì)胞懸液接種于預(yù)先用PDL 處理過的6 孔板中，然后放入培育箱過夜培養(yǎng)。棄混合培養(yǎng)液, 加入增殖液, 繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 OPCs定向誘導(dǎo)分化 純化過后的OPCs培養(yǎng)3 d 后，加入分化培養(yǎng)液定向分化，最后終止培養(yǎng)，吸出殘余培養(yǎng)基，進(jìn)行免疫熒光鑒定。

1.4.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取不同時間段培養(yǎng)的細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)，并拍照記錄。

1.4.5 細(xì)胞免疫熒光鑒定 去除培養(yǎng)液, 用PBS漂洗3 次，每次2 min； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 多聚甲醛固定20 min, PBS 漂洗3 次, 每次2 min； 0.5%Triton X-100室溫穿孔20 min, PBS漂洗3次，每次2 min；5%的山羊血清室溫封閉30 min，PBS 漂洗3 次，每次2 min； 對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和OPCs 分別滴加稀釋好的抗NG2、MBP(1∶200 稀釋)一抗，對照孔加PBS 代替一抗，4 ℃過夜孵育，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 避光條件下，加入Cy3 標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗，37 ℃孵箱1h，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 滴加DAPI 避光孵育5 min, PBS清洗3 次, 每次2 min； 吸走液體, 加入抗熒光淬滅劑(1∶500 稀釋), 在熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.6 MTT法測定OPCs生長曲線 純化培養(yǎng)后,選取單層生長的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液, 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度至1.5×104細(xì)胞/mL, 以每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板中, 設(shè)2 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h 和96 h 共9 組，每組3 個復(fù)孔，空白調(diào)零組為不接種細(xì)胞只加培養(yǎng)液,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，分別按設(shè)置的時間點，每孔加入MTT 20 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 去除培養(yǎng)液, 每孔加入200 μL DMSO, 37 ℃下溶解30 min，選擇波長490 nm，以空白組調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)胰酶消化后剛接種的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，呈圓形，折光性較強。接種10 min 就可見少量細(xì)胞開始貼壁，貼壁1 h 后轉(zhuǎn)移至經(jīng)PDL 處理過的培養(yǎng)瓶中, 8 h 后大部分細(xì)胞已貼壁。培養(yǎng)3 d后, 在熒光顯微鏡下觀察, 細(xì)胞表面開始長出突起，且多數(shù)細(xì)胞的體積較大，緊貼于瓶底生長,胞核較大，呈圓形或長條形，細(xì)胞扁平狀有較粗大的突起。少數(shù)為體積較小，胞體呈圓形或橢圓形, 具有單極或雙極細(xì)小突起的強折光性的細(xì)胞(圖1A ↑)。加入增殖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后，OPCs不斷分裂增殖并呈現(xiàn)出典型的雙極或三極形態(tài)、細(xì)胞核大、胞體較小、折光性較弱且呈圓形或橢圓形(圖1B ↑和1C)。加入分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，OPCs分化成未成熟(圖1D↑)或成熟OLs(圖1E↑)時，細(xì)胞突起數(shù)量明顯增加，突起變長且有分支，分支常交互形成“蜘蛛網(wǎng)”樣，極為茂密。

2.2 細(xì)胞免疫熒光染色

NG2 是OPCs的特異性標(biāo)志蛋白，而MBP是成熟OLs 特異性標(biāo)志蛋白[17]。分別使用這兩種蛋白的抗體對純化后的OPCs及分化后的OLs進(jìn)行免疫熒光染色，再使用攜帶Cy3 的熒光二抗標(biāo)記，DAPI 染核。結(jié)果顯示陽性細(xì)胞發(fā)紅色熒光，細(xì)胞核被染為藍(lán)色(圖2，圖3)。

對OPCs進(jìn)行NG2特異性抗體免疫熒光染色,結(jié)果顯示大部分細(xì)胞為NG2 陽性的OPCs(圖2)，形態(tài)為兩極或三極突起狀，還存在少量NG2陰性的雜細(xì)胞。

A： 10 倍, B： 20 倍圖 2 樹鼩OPCs 的NG2 免疫熒光染色Figure 2 Immunofluorescence staining of NG2 of tree shrew OPCs

對OLs 進(jìn)行MBP特異性抗體免疫熒光染色，結(jié)果顯示一部分細(xì)胞為MBP陽性的OLs(圖3)，形態(tài)為“蜘蛛網(wǎng)”樣的突起，但也存在較多的MBP陰性的雜細(xì)胞。

2.3 OPCs 生長曲線

在PDL 處理過6 孔板中，OPCs 可以在2 h內(nèi)全部貼壁，OPCs 從兩極開始伸出突起，在12 h 內(nèi)細(xì)胞增殖相對較慢，而在之后的時間里，出現(xiàn)明顯擴(kuò)增，而且呈現(xiàn)OPCs 的典型形態(tài)。在12～60 h，細(xì)胞增殖明顯，在此之間，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。72 h 后，細(xì)胞增殖變緩，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞開始不再增多而進(jìn)入分裂終期。根據(jù)每日測得的A490，取平均值作生長曲線(圖4)。

圖 4 樹鼩OPCs 生長曲線Figure 4 The growth curve of oligodendrocyte progenitor cell

3 討論

在CNS疾病或者損傷時，不僅可以導(dǎo)致?lián)p傷中心附近區(qū)域神經(jīng)元大量死亡，同時還能導(dǎo)致OLs 壞死和凋亡，最終導(dǎo)致軸突脫髓鞘化以及神經(jīng)功能恢復(fù)困難。移植OLs并不能有效形成髓鞘,再加上對髓鞘發(fā)育/再生過程中的分子機制還沒有完全了解，導(dǎo)致這類疾病迄今還沒有有效治療方法。OPCs 是CNS 中一類干細(xì)胞樣的細(xì)胞[15]，它可以不斷增殖，并且最終可分化為OLs、2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元[16]。因此有研究者[10]猜測OPCs 可能是治療CNS 疾病或者損傷的理想細(xì)胞。樹鼩大腦較發(fā)達(dá)，且比大鼠、小鼠更接近靈長類動物，是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病較為理想的實驗動物。分離培養(yǎng)高純度、高質(zhì)量的樹鼩OPCs是開展相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的基礎(chǔ)。

本實驗借鑒差速貼壁法以及傳統(tǒng)的恒溫?fù)u床分離法[9,14,15]和化學(xué)分離法[13]來純化體外培養(yǎng)的OPCs。OPCs 主要存在于大腦皮層，但從大腦皮層獲取的原代細(xì)胞種類中，不僅有OPCs，還有大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及尚不清楚的雜細(xì)胞[9]，因此，去除以上細(xì)胞污染、獲得純化的OPCs 是本實驗的關(guān)鍵。本試驗采用出生48 h 內(nèi)樹鼩，優(yōu)點之一是此時樹鼩的腦部還沒有進(jìn)一步分化發(fā)育，所含的OPCs 大部分還處于增殖階段，細(xì)胞活性高，易于體外培養(yǎng)[9]；其次，其腦膜易于剝離，能有效去除原代培養(yǎng)中成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞污染。去除腦膜、腦干等組織后的大腦皮層，使用胰酶和DNase I 聯(lián)合消化來獲得細(xì)胞懸液。通過對比單獨采用胰酶或胰酶和DNase I 聯(lián)合使用，表明兩者聯(lián)合使用，能降低細(xì)胞懸液的粘稠度，并能更好形成單細(xì)胞懸液。

利用OPCs 貼壁速度明顯慢于其他細(xì)胞的特點，對原代細(xì)胞進(jìn)行多次差速貼壁處理，可有效降低雜細(xì)胞污染，例如，成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等。在混合培養(yǎng)5 d 后，可更換培養(yǎng)液，加入增殖培養(yǎng)液。增殖培養(yǎng)液中低濃度血清以及細(xì)胞因子，不僅能抑制其他雜細(xì)胞生長，還可以促進(jìn)OPCs 增殖。

首次分離純化時，通過對比兩種不同分離方法，可清晰地發(fā)現(xiàn)化學(xué)分離法要優(yōu)于恒溫?fù)u床分離法。通過化學(xué)分離法純化，可以減少對OPCs機械損傷，尤其是對OPCs 突觸的損傷，大大提高了細(xì)胞活性，OPCs 的存活率可達(dá)到95%。其次，大大縮短分離時間, 簡化了純化步驟，一般恒溫?fù)u床分離需要20 h左右, 而化學(xué)分離只需孵育20 min。但化學(xué)分離法也存在缺點，孵育后需要用槍頭吸取培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞面，這能讓OPCs 充分地分離，但也導(dǎo)致一些雜細(xì)胞被吹打下來，影響了OPCs 的純度。

因此，對于首次分離純化的混合細(xì)胞，需再次采用兩次差速貼壁法進(jìn)一步純化OPCs。首先，最先純化的細(xì)胞，經(jīng)過離心稀釋成細(xì)胞懸液，在未被PDL處理過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板里孵育1 h，能有效除去較大和易貼壁細(xì)胞。其次，取上清細(xì)胞懸液接種于PDL處理過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中再孵育1 min，能進(jìn)一步除去較難貼壁的雜細(xì)胞，但同時也會損失部分OPCs。最后，將純化后細(xì)胞懸液接種于PDL處理過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板培養(yǎng)。純化時，全過程都使用混合培養(yǎng)液，其中的高濃度血清能減弱對OPCs 的損傷，提高細(xì)胞活性。純化后繼續(xù)培養(yǎng)，OPCs 能在2 h 內(nèi)完全貼壁，再換培養(yǎng)液進(jìn)行增殖或分化培養(yǎng)。

在原代未純化細(xì)胞中, 可以清晰觀察到OPCs形態(tài)主要以兩極或三極的突起為主，胞體較小且折光性強。經(jīng)過純化和分化培養(yǎng)后，觀察到OPCs 突起增多, 并且相互連接成“蜘蛛網(wǎng)”狀,胞體無明顯變化, 與文獻(xiàn)[3-9,14-16]的實驗報道相似(圖1C～1E)。

OPCs 增殖、分化和髓鞘形成過程受到細(xì)胞內(nèi)部性質(zhì)、細(xì)胞生存周期和其他細(xì)胞分泌(神經(jīng)元、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等)信號分子等因素的影響[3]。在OPCs 增殖、分化等培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的物質(zhì)和細(xì)胞因子, 可促進(jìn)其增殖、分化。有研究表明, PDGF-aa 和bFGF聯(lián)合使用[3]、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)[15]和15% B104 條件培養(yǎng)基[14]具有促進(jìn)OPC 增殖效應(yīng)。分化培養(yǎng)時，OPCs 缺少增殖能力，而無法除去的雜細(xì)胞也開始增殖，再加上OPCs 還能分化成2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞，OLs 其純度開始下降，這是定向分化的最大問題。有研究證明，分化液中人睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF)，不僅可誘導(dǎo)OPCs 分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞，也能誘導(dǎo)OPCs 分化成2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞[18]。因此建議，先讓細(xì)胞分化4 d，之后再加入CNTF 來提高細(xì)胞存活率，也可以限制OPCs 分化方向。而對于一些較難除去的雜細(xì)胞，只能增加差速貼壁時間，或者添加能抑制其增長的細(xì)胞因子。

綜上所述，本實驗采用化學(xué)分離法和差速貼壁法來分離純化OPCs，并對分離后細(xì)胞再進(jìn)行二次差速貼壁純化，能獲得活性高且純度高達(dá)97%的OPCs，且較其他方法如恒溫?fù)u床法、抗體免疫篩選法[17]簡便、可靠、易于推廣。本研究為樹鼩OPCs體外分離培養(yǎng)進(jìn)行了實驗性探索，也為今后開展樹鼩CNS 疾病模型奠定了基礎(chǔ)。