多浪羊雙肌臀基因Callipyge序列分析

方翟 范文斌 高慶華

摘要：綿羊的雙肌臀（Callipyge）基因表現型為后臀肌肉增大近30%，由位于綿羊第18號常染色體上基因上游存在一個N→ C的單核苷酸多態性（SNP）標記（命名為SNPCLPG）產生的，該SNP標記的存在與Callipyge表現完全吻合。為此，根據已知多態性，選擇設計合成了1對引物，以多浪羊為研究對象，對PCR擴增產物直接測序，進行了SNPCLPG位點的檢測。獲得303 bp的擴增片斷，測序后進行序列分析，發現在38 bp處堿基產生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產生T到C的突變。

關鍵詞：多浪羊;PCR;雙肌臀;突變

中圖分類號：S826 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2019）07-0005-03

多浪羊是新疆特有的一個優良的肉脂兼用型綿羊品種，因其中心產區在麥蓋提縣，故又稱麥蓋提羊。多浪羊體格大、產肉多、肉質鮮嫩、性成熟早、繁殖率高、遺傳性能穩定。大部分母羊可達到兩年三產，雙羔率達30%～40%，4～5月齡羔羊體重可達35 kg;育肥性能好，育肥羊屠宰率可達55%以上，是組織羔羊肉生產的理想品種。

在綿羊的品種改良中，培育產肉量高、肉質好、嫩度高的綿羊品種一直是育種工作者不懈的追求，通過傳統的遺傳改良和營養調控手段來提高動物的瘦肉率和肌肉品質已很難再有大的進展。近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展和動物基因組研究的深入開展，加快了對綿羊雙肌（Callipyge）性狀更進一步的研究。

研究發現該性狀是由于18號常染色體上的一個野生型等位基因（N）發生突變所致，而且該突變基因以非孟德爾方式遺傳[1]。目前試驗已證實了Callipyge突變基因以極性超顯性的方式遺傳。一般用C（代表突變基因Callipyge）、N（代表正常野生型基因）控制雙肌性狀的這一對等位基因，組成4種基因型（CC、CN、NC和NN），但僅有從父本中獲得CN基因型的雜合子公羊才表現出雙肌臀性狀，其他3種基因型個體都表現正常。

Callipyge 的遺傳效應在肉用型、毛用型和多胎型等得到了廣泛的研究，其中最顯著的就是提高雙肌臀羊的瘦肉率這一遺傳效應，Callipyge基因使雙肌臀羊腰部和腿部的肌肉過度發育而顯著增大;同時，該基因還能使皮下、肌間、肌內和腎臟周圍的脂肪減少，進而間接地增加了綿羊的瘦肉率。Freking等[2]的研究都證明了這一觀點，這和動物生產者的經濟利益相關性最強。此外，Callipyge基因還對屠宰率、飼料利用率、胴體性狀等產生一定的影響。

本研究采集多浪羊血液樣本，設計引物，擴增CalliPyge基因，旨在驗證多浪羊Callipyge基因是否存在突變。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品 ?在塔里木大學動物科學學院實驗站隨機選取23只多浪羊母羊，用10 mL的真空采血管（檸檬酸鈉抗凝）頸靜脈采血5 mL，放置在冰盒內帶回實驗室-80 ℃保存備用。

1.1.2 ?PCR引物設計 ?CalliPyge基因引物參照Freking[2]等在GenBank中發表的包括CLPGSNP位點的DNA序列（登錄號：AF401294）設計引物，長度為303 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物Calli-F：5′-CAGCAGCAGAGCAG

AGAAC-3′;下游引物Calli-R：5′-AAATTGGAAGGC

TTGGAGGT-3′。

1.1.3 ?主要試劑 ?血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit、離心柱型）（購自天根生化科技有限公司）、超純水、EB、Marker，Buffer、5倍TAE（Tris 12.1 g、EDTA 1.86 g、醋酸2.855 mL，蒸餾水加至500 mL）。

1.1.4 ?主要儀器與設備 ?主要儀器與設備名稱見表1。

1.2 ?方法

PCR擴增體系見表2。按照預試驗所得最適退火溫度為57 ℃， PCR反應優化條件為：94 ℃預變性4 min→94 ℃ 變性30 s→57 ℃ 退火30 s→72 ℃ 延伸1 min→72 ℃延伸10 min→于4 ℃保存，共進行35個循環。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將檢驗合格的PCR產物編號，放置于有冰袋的泡沫箱中，密封，寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司，雙通測序。

2 ?結果與分析

2.1 ?DNA提取結果

利用試劑盒提取多浪羊血液DNA，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現產物條帶單一，是所需要的目的條帶（圖1）。

2.2 ?PCR擴增結果

對Callipyge基因的引物進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現產物條帶單一，大小稍大于300 bp，與目的片段長度303 bp大小一致（圖2）。

2.3 ?測序結果

2.3.1 ?直接測序結果 ?生工生物工程（上海）股份有限公司的測序結果為303 bp，與目的片段長度303 bp符合。利用Chromas軟件將測序結果導出，其中部分測序結果見圖3。

2.3.2 ?堿基數目分析 ?通過對23個樣品進行統計分析發現，堿基A占28.12%，堿基T占29.85%，堿基C占24.54%，堿基G占17.49%。其中C+G含量占42.03%，A+T含量占57.97%，A+T含量遠高于C+G的含量。

2.3.3 ?突變分析 ?用NDAMAN分析，Identity=99.79%，在38 bp處堿基A突變為G，在80、92、149、219 bp處堿基T突變為C（圖4）。

3 ?討論

多浪羊個體大、生長發育快、早熟性好，有寶貴的多胎性和繁殖率高、采食能力強、飼料報酬高、產肉性能好、肉質鮮美可口、被毛絨毛多、毛質較好、性情溫順、遺傳性穩定等特點，廣受養殖戶的喜愛。Callipyge基因可有效提高綿羊的瘦肉率、屠宰率和飼料利用率等性能。本研究檢測了雙肌臀基因在多浪羊上的表達，尋找其突變位點。王海亮等[3]研究發現第184 bp處C突變為T，證明可能與山羊雙肌性狀有關。劉曉敏等[4]對歐拉型藏羊Callipyge基因多態性與生長性狀相關性進行研究，發現在176 bp處有N到C的突變。李云龍等[5]對寧夏回族自治區賀蘭和鹽池縣分別采集87頭灘羊、73頭特克塞爾羊、70頭薩福克羊和112頭無角陶賽特羊的血樣研究后發現，在四個綿羊品種中沒有檢測到決定Callipyge表型的A→G單堿基突變，但在該位點上游35 bp處檢測到一個C→T的突變。

4 ?結論

本研究通過從多浪羊的血樣中提取DNA，將提取到的DNA進行PCR擴增，將擴增產物進行直接測序，測序后利用DNAstar比對分析，在38 bp處堿基產生A到G的突變，在80、92、149、219 bp處堿基產生T到C的突變。

參考文獻：

[1] YEN M Y，LIU Y C，WANG J H，et al.Streptococcus suis meningitis compli-cated with permanent perceptive deafness：report of a case[J]，Formos Med Assoc，1994，93（4）：349-351

[2] FREKING B A，KEELE J W，BEATTIE C W，et al. Evaluation of the ovine callipyge locus：I. Relative chromosomal position and gene action.[J].Journal of animal science，1998，76（8）：2062-2071.

[3] 王海亮，李祥龍，周榮艷，等.山羊Callipyge基因型的檢測[J].中國畜牧獸醫，2007（11）：49-51.

[4] 劉曉敏，張利平，楊 ?聯，等.歐拉型藏羊Callipyge基因多態性與生長性狀相關性研究[J].甘肅農業大學學報，2010（4）：1-4，9.

[5] 李云龍，楊章平，毛永江，等.綿羊Callipyge基因概述[J].畜牧獸醫雜志，2008（2）：31-34.