雙孢蘑菇內參基因的篩選與矯正

趙建霞，沈穎越，馮偉林，金群力，宋婷婷，范麗軍，蔡為明，*

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是在傳統聚合酶鏈式反應基礎上發展起來的一項新核酸定量技術，目前已廣泛應用于分子診斷學、農學、微生物、醫學等眾多研究領域[1-3]。盡管RT-qPCR是一種強有力的工具，但是RT-qPCR數據處理和分析結果往往會受到不同變量的影響，與目標基因特異性表達的真實值存在一定的誤差，這些變量包括起始材料、RNA質量(純度、完整性、DNA的污染)、反轉錄效率、擴增效率和內參基因等[4]。在基因表達分析中，通常利用在多個差異樣本中穩定表達的內參基因對測試基因表達量進行校正和標準化[5]，從而控制樣品內部或樣品間不必要的誤差[6]。在不同細胞組織、發育階段或試驗條件下，個別傳統內參基因表達水平是不穩定的[7]。因此，在使用RT-qPCR進行基因表達分析時，內參基因的選擇不僅需要多個基因共同參與，且應根據特定的試驗材料、試驗條件進行選擇。

雙孢蘑菇是世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，具有重要的經濟價值[8]。中國自20世紀30年代引入栽培雙孢蘑菇以來，已在全國各地推廣種植，種植面積較大的有福建、山東、河南、浙江等省[9]。隨著雙孢蘑菇基因組測序結果的公布，越來越多研究關注雙孢蘑菇的功能基因，因此功能基因的表達分析也變得越來越重要，然而基因的表達分析與內參基因的選擇密切相關。目前。雙孢蘑菇內參基因的篩選研究卻未見相關報道。在其他農作物與食用菌物種的基因表達研究中，核糖體RNA基因(18s)[10]、核糖體蛋白基因(RPL14)[11]、肌動蛋白基因(actin)[12]、轉錄延伸因子(EF1)[13]、磷酸甘油醛脫氫酶基因(GADPH)[14]、泛素基因(ubiquitin)[15]、真核翻譯起始因子(Eif5)[16]、核糖體RNA基因(40s)等常被用作內參基因，且大部分研究以單個基因作為內參基因，但單個基因大的表達穩定性有限且更易受到不確定性因素影響。本研究目標是在雙孢蘑菇的5個不同發育時期、3個不同組織結構、4個不同溫度處理的特定試驗背景下進行最佳RT-qPCR內參基因的選擇。通過RT-qPCR反應獲取以上8個候選內參基因的Ct值，并綜合使用geNorm[17]、NormFinder[18]軟件和ΔCt[19]法評估單個基因及其雙基因組合和3基因組合在不同試驗組別中的表達穩定性。由于它們的分析原理和側重點不同，分析結果往往存在差異，本研究對3種分析方法所得結果進行綜合排序，以期減少分析誤差，不僅彌補了目前雙孢蘑菇內參基因缺乏的不足，也克服了不同分析方法導致的分析誤差，同時采用組合基因的方法有效提高了最佳內參基因的穩定性，為雙孢蘑菇相關基因差異表達分析的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養基和試劑

雙孢蘑菇菌株為英秀一號。

固體培養基(1 L)：PDA培養基中加入20 g發酵稻草、20 g麥粉浸汁。

液體培養基：食藥用菌-液體菌種培養基，購自雅康生物科技。

原種培養基：98%麥粒，1%石灰，0.5%酵母粉，0.3%蛋白胨，0.1% KH2PO4，0.1% MgSO4。

栽培種培養料：50%蔗渣，30%棉籽殼，18%麩皮，0.5%酵母粉，0.3%磷酸二氫鉀，0.1%輕質碳酸鈣，0.1%硫酸鎂，pH 8。

主要試劑有RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)、RNase-Free DNase Set(Qiagen)、SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)、Power SYBR? Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)。

儀器有高速冷凍離心機(Sigma)，紫外分光光度計(Beckman)，恒溫金屬浴(國產)，CFX384多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)。

1.2 試驗方法

不同發育時期樣品：在雙孢蘑菇的菌絲期(麥粒種)、菇蕾期、幼菇期、小菇期、采摘期進行整菇取樣，如圖1，每個時期3個生物學重復。不同組織樣品：對采摘期菌蓋、菌柄、菌褶進行取樣，各3個生物學重復。不同溫度處理樣品：將雙孢蘑菇菌絲接種至液體培養基，25 ℃培養10 d，分別放置5、15、25、30 ℃靜置12 h后對菌絲進行取樣。每個溫度進行3個生物學重復。

自左至右依次為菇蕾期、幼菇期、小菇期、采摘期。From left to right were mushroom bud stage， young mushroom stage， small mushroom stage and picking stage， respectively.圖1 雙孢蘑菇子實體不同發育時期Fig.1 The different developmental stages of Agaricus bisporus

1.3 總RNA提取與質量檢測

所有樣品的總RNA按照Qiagen試劑盒說明書要求進行提取，所獲得的總RNA經過DNA酶處理，去除DNA污染。利用紫外分光光度計(Beckman)測定總RNA的濃度、純度，通過瓊脂糖凝膠檢驗RNA完整性。

1.4 內參基因引物設計與cDNA第一鏈的合成

所有候選內參基因序列來自GJIAgaricusBisporusH97基因組序列[20]。利用Primer5.0軟件設計引物，由上海擎科生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。預計所有擴增片段長度在103～160 bp，引物退火溫度在55.7～57.6 ℃。反轉錄cDNA采用快速反轉錄試劑盒(Invitrogen)，具體操作依據試劑盒說明，將RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存備用。

1.5 熒光定量PCR反應條件

RT-qPCR反應按照Power SYBR? Green PCR Master Mix試劑說明書進行。RT-qPCR反應在CFX384型多重實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上運行，擴增體系20 μL： Power SYBR? Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板(≈10 ng)1 μL，ddH2O 8 μL。反應程序為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40個循環；從55 ℃到95 ℃，每個循環增加0.5 ℃，持續0.05 s獲得解鏈溫度，采集融解曲線熒光信號。

1.6 候選內參基因的擴增效率與特異性

將反轉錄的cDNA混合樣品用ddH2O以10倍濃度梯度稀釋4個梯度(1，1∶10，1∶100，1∶1 000)，以此為模板進行RT-qPCR擴增后制作內參基因的標準曲線[21-22]。每個樣品3個重復，統計其循環閾值(Ct值)。以cDNA稀釋濃度為橫坐標，Ct值為縱坐標，經對數擬合做標準曲線，計算各內參基因的回歸系數，依據計算公式E=10-1/slope-1計算擴增效率(E為擴增效率，slope為回歸直線斜率)。RT-qPCR反應產物在4%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測鑒定內參基因引物特異性。

1.7 管家基因表達水平及其穩定性

有4種算法廣泛應用于qRT-PCR數據分析：geNorm、NormFinder、BestKeeper[4]、ΔCt法。因為BestKeeper程序最多只能比較10個內參基因的表達水平，本研究中除8個候選單基因外，還有雙基因組合及三基因組合，共92個候選內參基因需要比較計算，因此該方法此處不適用。本研究將5個不同發育時期、3個不同組織、4個不同溫度處理菌絲的cDNA作為模板，對8個候選內參基因進行RT-qPCR定量分析，每個生物學重復的樣本進行3次技術重復，獲取8個候選內參基因的Ct值。由于Ct值是指數型數據，此處組合基因的Ct值用參與組合的單個基因Ct值的算數平均數表示[23]。然后對單基因、雙基因組合和3基因組合的Ct值運用Genorm、Norm Finder軟件和△Ct法進行分析。

表1 八個候選內參基因RT-qPCR引物

Table 1 RT-qPCR primers for eight candidate internal reference genes

基因Gene聯合基因組研究所編碼Joint Genome Institute Identity引物序列(5’-3’)Primer sequence (5’-3’)產物長度Product length/bp40s191562GCATCCGTTCTGGAGGTGAGGGACTGGCGCATACAACATTTAC15918s186957CGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCGCTTTCGCAGTAGTCGGTCTTG126actin148219GCAGGTTATGATGCTCGTGTTAGCATGAGTGCCTCTTGTTCTATTCG150EF1189244GGCAGGGATTGATGGACTTTGAGTTGGAACGCCCGCTTAATTTCTT160GAPDH192199GAGCAAGGAAATTAGCAAGAGTAGCGACGACGATATGGTCAGGGTGTT133ubiquitin133168GATCTTTGCTGGCAAACAACTCGACATACCACCACGCAGACGGA103RPL14189164CCCCTACAAACACCTTCTTCTCACCTCCGCTTCTCCTTCATCAC3160Eif5191428CTCTATTCACTGACGAAGCTACCACGAGACGCTCCAAACCACCA114

2 結果與分析

2.1 RNA質量檢測

用于實時熒光定量分析的RNA質量是非常重要的影響因素[5]。本研究提取的RNAD260/D280均在1.91～2.0，RNA濃度為121～156 ng·μL-1，RNA電泳圖如圖2。

2.2 候選內參基因引物擴增效率與特異性

以4個稀釋梯度的混合cDNA為模板進行RT-qPCR擴增，得到候選內參基因的擴增曲線和標準曲線，結果表明，各內參基因的熔解曲線有明顯的單一信號峰，重復樣品間擴增曲線重復性高，且不加模板的陰性對照檢測不到熒光信號，說明RT-qPCR反應具有較高的專一性。RT-qPCR結果(表2)顯示各內參基因的線性關系決定系數R2≥0.990，引物的擴增效率為85.6%～105.7%，符合RT-qPCR對擴增效率的要求。8個候選內參基因的引物均可以擴增出單一且與目的片段大小一致的條帶，沒有出現引物二聚體和非特異性擴增(圖3)。

1，雙孢蘑菇的菌絲期(麥粒種)；2，菇蕾期；3，幼菇期；4，小菇期；5，采摘期；6，采摘期菌蓋；7，采摘期菌柄；8，采摘期菌褶；9，5 ℃處理12 h的菌絲；10，15 ℃處理12 h的菌絲；11，25 ℃處理12 h的菌絲；12，30 ℃處理12 h的菌絲。1， Agaricus bisporus mycelium period (wheat); 2， Mushroom bud stage; 3， Mushroom young stage; 4， Mushroom small stage; 5， Harvest stage; 6， Harvest pileus; 7， Harvest lid; 8， Harvest gills; 9， 5 ℃ treatment 12 h of hyphae; 10， 15 ℃ treatment 12 h of hyphae; 11， 25 ℃ treatment 12 h of hyphae; 12， 30 ℃ treatment 12 h of hyphae.圖2 RNA完整性檢測電泳圖Fig.2 RNA integrity detection

2.3 Ct值比較

基因表達豐度越高，Ct值越小，反之，Ct值越大。8個候選內參基因的Ct值比較表明，在不同發育時期、不同組織、不同溫度處理的各個樣品中，每個內參基因的表達水平都有一定的變化，且表達豐度變化呈現相近趨勢。18s表達豐度最高，Eif5表達豐度最低，40s、GAPDH、EF1、RPL14、ubiquitin、actin的Ct值居中(圖4)。

2.4 qRT-PCR數據分析

2.4.1 geNorm軟件分析

本研究中使用的geNorm是免費的Excel加載項，根據計算出的候選內參基因在不同樣品中的平均變異值M(average pairwise variation)來確定最穩定的內參基因，M值越大，表明穩定性越低；M值越小，穩定性越高，M=1.5是上限。計算組合基因時，以組合基因的幾何平均值計算候選基因的表達穩定性因子(M值)。結果(表3)表明：不同發育階段最適內參基因組合為40s+GAPDH；不同組織組中最適內參基因組合為40s+actin+ubiquitin，最適的雙內參基因組合為actin+RPL14，排名第5位；不同溫度處理中最適內參基因組合為EF1+ubiquitin+PL14，最適的雙內參基因組合為EF1+ubiquitin。

2.4.2 Norm Finder軟件分析

表2 RT-qPCR分析中8個內參基因相關參數

Table 2 Parameters of eight reference genes derived from RT-qPCR analysis

基因名稱Gene name斜率Slope決定系數R2Correlation擴增效率PCR efficiency/%40s-3.1920.996105.718s-3.5080.99792.8actin-3.4090.99096.5EF1-3.2860.990101.5GAPDH-3.7210.98985.7ubiquitin-3.3940.98787.6RPL14-3.7250.99885.6Eif5-3.6460.99788.1

M， DNA marker 2 000.圖3 八個候選內參基因的RT-qPCR產物Fig.3 RT-qPCR products of eight candidate internal reference genes

圖4 八個候選基因在不同處理雙孢蘑菇樣品中平均Ct值比較Fig.4 Average Ct values of eight candidate genes of Agaricus bisporus samples in different treatments

表3 雙孢蘑菇候選內參基因及其組合的表達穩定性(Genorm軟件)

Table 3 Expression stability of candidate reference genes ofAgaricusbisporusand their combinations(Genorm software)

穩定性排名Ranking不同發育階段Different development stages基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同組織Different tissue groups基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同溫度Different temperature treatment基因Gene平均標準差Mean standarddeviation140s+GAPDH0.78340s+actin+ubiquitin0.631EF1+ubiquitin+RPL140.451240s+GAPDH+ubiquitin0.796Actin+ubiquitin+RPL140.641EF1+GAPDH+ubiquitin0.4523EF1+RPL140.79740s+actin+Eif50.67340s+EF1+ubiquitin0.4654GAPDH+ubiquitin+RPL140.80040s+18s+ubiquitin0.680GAPDH+ubiquitin+RPL140.473540s+actin+GAPDH0.807actin+RPL140.683EF1+ubiquitin0.4836GAPDH+RPL140.810actin+RPL14+Eif50.686EF1+GAPDH+18s0.4997EF1+GAPDH+RPL140.81840s+actin0.68640s+GAPDH+ubiquitin0.499840s+EF1+GAPDH0.82140s+actin+RPL140.69240s+GAPDH+18s0.503940s+EF10.82240s+ubiquitin0.70940s+ubiquitin+RPL140.5031040s+actin+EF10.827actin+EF1+RPL140.709EF1+ubiquitin+Eif50.512

Norm Finder是基于Excel的VBA(visual basic for applications)程序，可以在一組候選者中鑒定最佳內參基因，該算法根據候選內參基因的穩定值大小來篩選出最合適的內參基因，它不僅能評估候選參考基因在總體樣本集中的表達穩定性，還能評估候選參考基因在樣本集亞組之間的差異。表4顯示，不同發育時期Eif5+18s的基因組合表達最穩定，不同組織中RPL14+Eif5+EF1的基因組合表達最穩定，其中表達最穩定的雙基因組合為actin+RPL14。不同溫度處理中40s+18s+GAPDH表達最穩定。

2.4.3 ΔCt法分析

相對表達穩定性算法為：首先獲得每個候選基因與剩余所有單個候選基因所對應的Ct值的差值(ΔCt值)，再計算每個組合中ΔCt值的標準差(StdDevΔCt值)，最終得到平均SDΔCt值標準差(Mean StdDevΔCt值)，以Mean StdDevΔCt值對每個候選基因進行排序，Mean StdDevΔCt值最小的基因為最穩定的內參基因。利用ΔCt法比較所有樣品中單個候選內參基因與所有剩余單個候選內參基因間的相對表達穩定性，來評估最穩定的參考基因。ΔCt法分析結果如表5所示，不同發育時期中40s+actin+EF1的基因組合表達最穩定，其中表達最穩定的雙基因組合為40s+EF1。不同組織中40s+actin+Eif5組合表達最穩定，其中表達最穩定的雙基因組合為actin+RPL14。不同溫度處理中EF1+ubiquitin+RPL14組合表達最穩定。

表4 雙孢蘑菇候選內參基因及其組合的表達穩定性(Norm Finder軟件)

Table 4 Expression stability of candidate reference genes ofAgaricusbisporusand their combinations(Norm Finder software)

穩定性排名Ranking不同發育階段Different development stages基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同組織Different tissue groups基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同溫度Different temperature treatment基因Gene平均標準差Mean standarddeviation118s+Eif50.001EF1+RPL14+Eif50.03740s+GAPDH+18s0.0482GAPDH+ubiquitin+RPL140.002actin+EF1+RPL140.042EF1+ubiquitin+RPL140.0603EF1+18s+ubiquitin0.002actin+RPL14+Eif50.04340s+EF1+18s0.0624actin+EF1+Eif50.00540s+actin+Eif50.04340s+EF1+ubiquitin0.0655actin+GAPDH+ubiquitin0.005EF1+ubiquitin+RPL140.047actin+EF1+ubiquitin0.066640s+EF1+Eif50.00540s+actin+EF10.048GAPDH+18s+RPL140.067740s+GAPDH+ubiquitin0.005actin+RPL140.04840s+18s+RPL140.068818s+RPL14+Eif50.006actin+EF1+GAPDH0.051GAPDH+ubiquitin+RPL140.0689GAPDH+RPL14+Eif50.00640s+EF1+ubiquitin0.05540s+actin+18s0.06910EF1+RPL140.006EF1+GAPDH+Eif50.058EF1+GAPDH+18s0.070

表5 雙孢蘑菇候選內參基因及其組合的表達穩定性(ΔCt法)

Table 5 Expression stability of candidate reference genes ofAgaricusbisporusand their combinations(ΔCt method)

穩定性排名Ranking不同發育階段Different development stages基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同組織Different tissue groups基因Gene平均標準差Mean standarddeviation不同溫度Different temperature treatment基因Gene平均標準差Mean standarddeviation140s+actin+EF10.49940s+actin+Eif50.451EF1+ubiquitin+RPL140.313240s+EF1+ubiquitin0.503actin+EF1+RPL140.45440s+GAPDH+Eif5s0.314340s+GAPDH+ubiquitin0.510actin+RPL14+Eif50.46140s+EF1+ubiquitin0.3184EF1+ubiquitin+RPL140.51140s+actin+EF10.46440s+ubiquitin+RPL140.324540s+EF10.52040s+actin+ubiquitin0.471actin+RPL14+Eif50.3246EF1+RPL140.528actin+RPL140.47340s+actin+Eif50.3267actin+EF1+RPL140.530EF1+GAPDH+Eif50.474GAPDH+18s+RPL140.328840s+actin+GAPDH0.53440s+18s+ubiquitin0.48040s+actin+ubiquitin0.330940s+EF1+GAPDH0.53540s+actin0.481actin+EF1+ubiquitin0.33110GAPDH+ubiquitin+RPL140.535actin+ubiquitin+RPL140.48340s+18s+RPL140.331

2.4.4 綜合排名

由于以上3種內參基因的評定方法與原理存在一定差異，得出3種相似但不同的排序結果，對3種計算結果排名的幾何平均數進行綜合排名[15，24]，綜合排序前10名的如表6、表7、表8。不同發育時期EF1+actin+40s的三基因組合表達最穩定；不同組織中以Eif5+actin+40s的三基因組合表達最穩定，其中表達最穩定的雙基因組合為actin+RPL14；不同溫度處理組以EF1+ubiquitin+RPL14的三基因組合表達最穩定。

表6 不同發育時期最適內參基因前10名

Table 6 The top ten most suitable genes for internal reference at different developmental stages

不同發育階段Different development stagesGenorm結果排名Rank by GenormNorm Finder結果排名Rank by Norm FinderΔCt法結果排名Rank by ΔCt method3種排序的幾何平均數Geometric average ofthe three rangking綜合排名Overallranking40s+actin+EF110112.154435140s+GAPDH+ubiquitin21334.272659240s+actin+GAPDH5284.308869340s+EF1+ubiquitin19926.993191440s+EF1+GAPDH8797.958114540s+GAPDH159149.382675640s+actin+Eif51561210.259867EF1+RPL14373610.95297840s+actin+ubiquitin3141311.725249GAPDH+ubiquitin+RPL144501012.5992110

表7 不同組織最適內參基因前10名

Table 7 The top ten of the most suitable internal reference genes in different tissues

不同組織Different tissueGenorm結果排名Rank by GenormNorm Finder結果排名Rank by Norm FinderΔCt法結果排名Rank by ΔCt method3種排序的幾何平均數Geometric average ofthe three rangking綜合排名Overallranking40s+actin+Eif54132.2894281actin+EF1+RPL1422103.4199522actin+RPL14+Eif53363.779763340s+actin+ubiquitin11513.8029524actin+RPL147624.379519540s+actin+EF164126.6038546actin+ubiquitin+RPL14151026.694330740s+18s+ubiquitin23849.028715840s+actin14979.5900949EF1+RPL14+Eif5124399.78194610

表8 不同溫度處理的菌絲最適內參基因前10名

Table 8 The top ten of the most suitable internal reference genes in mycelia treated with different temperatures

不同溫度Different temperature treatmentGenorm結果排名Rank by GenormNorm Finder結果排名Rank by Norm FinderΔCt法結果排名Rank by ΔCt method3種排序的幾何平均數Geometric average ofthe three rangking綜合排名OverallrankingEF1+ubiquitin+RPL141211.259921140s+GAPDH+18s8122.519842240s+EF1+ubiquitin3433.301927340s+ubiquitin+RPL1491247.5595264GAPDH+18s+RPL1411677.7306145GAPDH+ubiquitin+RPL1448157.829735640s+EF1+18s153117.9104607EF1+ubiquitin214198.1028398actin+EF1+ubiquitin12598.1432539EF1+GAPDH+18s610139.20516410

3 結論與討論

目前，有關內參基因篩選的研究大多是評估單個基因的表達穩定性[25-27]，本研究不僅評估了8個候選內參基因的穩定性，還評估了8個候選基因的全部雙基因組合和三基因組合的穩定性。組合基因的Ct值用參與組合的單個基因的幾何平均數表示，不同組別中不同評估方法所得研究結果表明，除個別候選基因外，三基因組合的穩定性高于雙基因組合，雙基因組合穩定性優于單基因，與Pabuayon等[23]的報道一致，同時也證明了選用組合基因作為內參進行RT-qPCR的校正和標準化很有必要。

目前最佳內參基因的評價方法還沒有統一，因此，通過3種廣泛使用的算法(GeNorm、Norm Finder、ΔCt法)評估候選基因在雙孢蘑菇不同發育時期、不同組織、不同溫度處理等多個測試組內的穩定性，能有效中和計算誤差。這3種算法分別預測了相同組別內候選基因的穩定性排序，但是3種處理候選基因的排序存在一定差異，這可能是由于3種算法的原理不同導致的，也說明了不同算法對研究結果存在干擾與誤導。因此，本研究使用3種排序的幾何平均數來獲得所選內參基因的相對排名，這樣可以大大減少由于算法不同導致的計算偏差[28]。

3種算法的綜合分析結果表明，雙孢蘑菇不同發育時期樣本中最佳內參基因組合為40s+actin+EF1，最佳雙基因組合為40s+GAPDH；不同組織中最佳內參基因組合為40s+actin+Eif5，最佳雙基因的組合為actin+RPL14；不同溫度處理菌絲樣品中最佳內參基因組合為EF1+ubiquitin+RPL14。所有組合基因(92個組合)中排前10名的多數為三基因組合，最佳基因組合均為三基因組合，但個別雙基因組合也名列其中，由于以雙基因作為內參基因能節約時間、降低成本，因此位列前10名的雙基因組合也是可選組合，可根據試驗需求選擇合適的組合基因。另外，最佳的組合基因不一定是最佳單基因的簡單組合，可能是相對不穩定基因間的互補協作。

本研究結果可為雙孢蘑菇不同發育階段、不同組織器官，以及不同溫度處理中相關基因表達分析提供內參基因的篩選提供參考，同時也可為其他食用菌內參基因的篩選提供參考和借鑒。