馬鈴薯油菜素內酯信號激酶基因StBSKs的克隆與序列分析

馬 杰，鄭 好，周 平，陳春艷，吳 瑞，馬 維，宋 雷，孫 勃，*

(1.四川農業大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.畢節市農業科學研究所，貴州 畢節 551700)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是茄科茄屬一年生草本植物[1]，原產于南美洲安第斯山區，自17世紀傳入我國后，就已成為我國傳統的、主要的糧食作物之一，也是重要的蔬菜、飼料和工業原料，以及多用途的高產、高適應性農作物[2]。馬鈴薯具有效益高、耐瘠薄、產業鏈長、易于加工、營養價值高等優勢[3]。油菜素內酯(brassinolide，BR)是廣泛存在于植物中的相似于動物甾醇類激素的一種天然產物[4]。大量植物生理與分子生物學研究結果表明，油菜素內酯在植物的正常生長發育過程中是不可缺少的[5]，許多植物生理學家已將其列為植物的第6大類激素。BR普遍存在于植物中，在植物的不同器官，如根、莖、葉、花粉、雌蕊、果實和種子中均有分布[6]。BR參與調控植物生長發育、植物與環境間的相互作用，并能增加作物產量、改善品質和增強作物抗逆性[7]，還能夠提高作物的抗冷性[8]、抗熱性[9]、抗旱性[10]等。BR之所以具有這些功能，可能是因為BR可以激活植物中的氧化酶保護系統，從而盡快消除植物體內由于逆境而產生的過多有害自由基，提高植物抵抗逆境的能力[11]，以此增強植物抗性。擬南芥中存在12種BSK蛋白激酶，這12種都屬于受體細胞質蛋白激酶第12家族(RLCK-XII)。BSK1是BR信號通路中的一個重要的信號轉導激酶，它與定位在膜上的BRI1結合并在BR誘導下，作為BRI1的底物被激活，從而將BR信號傳導到下游，介導BR誘導的抗氧化防護酶活性的增強[4]。

目前，關于BR信號轉導途徑的研究大都僅限于擬南芥信號轉導途徑組分的同源基因克隆和相應突變體的分析[12]，BSK基因在擬南芥[13]、水稻[14]、玉米[4]等中有部分研究，但在馬鈴薯中的研究尚未見報道。本試驗克隆了馬鈴薯StBSK基因家族的7個成員，為進一步研究馬鈴薯StBSK基因的調控功能奠定了分子基礎，也為明確StBSK基因在增加馬鈴薯植株的脅迫耐受能力中的作用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以馬鈴薯栽培品種宣薯2號為材料，2017年9月將其原原種塊莖播種于花盆中，定期進行水肥管理，21 d后剪取馬鈴薯植株幼苗的3～5片真葉，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA提取。

1.2 試驗試劑

反轉錄試劑盒、DL 2 000 DNA marker購于大連寶生物公司，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase聚合酶、Trans1-T1克隆感受態細胞、克隆載體pEASY-Blunt等購于北京全式金生物技術有限公司，氨芐青霉素(Amp)、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒等購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 總RNA提取與反轉錄cDNA合成

采用改良的CTAB法[15]提取馬鈴薯的RNA，電泳檢測RNA的完整性，并利用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度(D260/D280=1.8～2.0為宜)。選取質量較好的RNA依據TaKaRa反轉錄試劑盒說明書合成cDNA模板，所得產物于-20 ℃保存。

1.4 基因克隆

根據NCBI已公開的擬南芥等BSK基因序列，設計馬鈴薯BSKs基因特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(40 μL)：pfuFly聚合酶0.8 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.6 μL，cDNA模板1.6 μL，Buffer 8 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)3.2 μL，ddH2O 23.2 μL。其中，StBSK1、StBSK4、StBSK6、StBSK7的反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個循環；72 ℃ 10 min。StBSK2、StBSK3、StBSK5的反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個循環；72 ℃，10 min。

擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收產物。將產物連接至平末端pEASY-Blunt克隆載體上，轉入大腸埃希菌Trans1-T1感受態細胞中，涂布于含IPTG、Amp和X-gal的LB平板上，倒置于37 ℃生化培養箱培養8～12 h，待長出明顯而又未相互重疊的單菌落時，將平板放置于4 ℃數小時至顯色完全。挑取10個生長狀態良好的白色單菌落于1 mL LB培養基中擴大培養。以菌液為模板進行PCR擴增，將電泳檢測條帶長度為1 500 bp左右的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 馬鈴薯StBSKs基因克隆引物

Table 1 The cloning primer ofStBSKsinSolanumtuberosum

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence (5’-3’)StBSK1-FGGGTTATCATGGGTTGTTGTCAATCTTCStBSK1-RAGGGTATTATCAAGATGCACGTCCAStBSK2-FAGCTGATGAAAAATGGGCTGTTTACAGStBSK2-RCCAGAATCAGTTACGCCAACTGTTTAACStBSK3-FGGGGTAATAGGATGGGCTGTGAGStBSK3-RTCGCCACTTTCAGGAATTTGTGTTCStBSK4-FGTTGGATAGTGTGATGGGCTGTGAAAStBSK4-RGCCACTTTCAAGAAGATGTGTTTTTCTCStBSK5-FTGCTCTGAAATGGGTGGTCGTTCStBSK5-RTTAATTTTTGCTCCTTTTGCCTTCCAACTStBSK6-FTGTTTTCATTTTCACTGTCAAATGGGTGCStBSK6-RAATGCAAATCTATACAGTTTCAGTTTTTGTStBSK7-FATGGGTGGTCGTTGTTCCAATTTATGStBSK7-RTTATTGTCTCATTCTTCTGAAGTCCAAGG

1.5 生物信息學分析

利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件預測StBSKs基因的相對分子質量、等電點、不穩定指數等理化性質；由TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件分析和推測蛋白質跨膜結構；通過WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)軟件進行亞細胞定位預測；使用NCBI-BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)結合DNAMAN 6.0軟件進行同源序列比對和保守結構域分析；用MEGA 6.0軟件進行系統進化樹的構建[16-17]。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StBSKs基因的克隆

經電泳檢測可明顯地觀察到28S和18S條帶，且28S條帶的亮度在18S條帶亮度的2倍以上(圖1)，D260/D280比值為1.9，表明馬鈴薯總RNA質量合格，可用于后續克隆試驗。將StBSKs基因的PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別得到7個長度約為1 500 bp的特異性條帶(圖2)，這些條帶大小與預測片段一致。陽性克隆測序得到7條長度分別為1 497、1 479、1 464、1 461、1 476、1 476和1 476 bp的序列，并將其分別命名為StBSK1、StBSK2、StBSK3、StBSK4、StBSK5、StBSK6和StBSK7。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 StBSKs蛋白理化性質分析和亞細胞定位預測

馬鈴薯StBSKs基因所編碼的氨基酸序列的理化分析結果如表2所示。不穩定指數小于40為穩定蛋白，大于40為不穩定蛋白，由此可知，StBSK1、StBSK3、StBSK4和StBSK5為不穩定蛋白，而StBSK2、StBSK6和StBSK7為穩定蛋白。平均疏水指數均為負值，表明其均為親水性蛋白。StBSKs蛋白的氨基酸組成具體見表3；SignalP、TMHMM等軟件分析發現，StBSKs蛋白均不存在信號肽結構和跨膜結構域，均為非分泌蛋白或膜外蛋白。亞細胞定位表明，StBSK1主要位于細胞核，StBSK2、StBSK3、StBSK4主要位于細胞質，StBSK5、StBSK7主要位于葉綠體，StBSK6主要位于線粒體。

圖1 馬鈴薯總RNAFig.1 Total RNA extracted from Solanum tuberosum

M， DL 2 000 marker; 1， StBSK1; 2， StBSK2; 3， StBSK3; 4， StBSK4; 5， StBSK5; 6， StBSK6; 7， StBSK7。圖2 馬鈴薯StBSKs基因PCR擴增產物Fig.2 PCR amplification products of StBSKs in Solanum tuberosum

表2 馬鈴薯StBSKs基因家族生物信息學分析結果

Table 2 Bioinformatics analysis ofStBSKsgene family inSolanumtuberosum

基因Genes長度Length/bp氨基酸數Aminoacidnumber理論分子量Calculatedmolecularmass/ku理論等電點Isoelectricpoint(pI)總原子個數Totalnumberof atoms不穩定指數Instabilityindex脂肪指數Liposolubleindex平均疏水指數Averagehydrophobicindex亞細胞定位Subcellularlocalization轉運肽長度Transitpeptidelength分子式MolecularformulaStBSK1149749855648.005.77771541.7075.06-0.421細胞核Nucleus32C2435H3815N685O750S30StBSK2147949255242.975.83773439.2583.29-0.378細胞質Cytoplasm4C2441H3856N672O741S24StBSK3146448754732.225.64763146.5781.17-0.407細胞質Cytoplasm21C2399H3794N676O735S27StBSK4146148654237.635.14756444.7483.17-0.288細胞質Cytoplasm4C2391H3760N650O737S26StBSK5147649154930.435.90762544.1777.15-0.336葉綠體Chloroplast39C2410H3776N674O734S31StBSK6147649155245.086.05769636.9179.33-0.326線粒體Mitochondria4C2452H3818N670O727S29StBSK7147649155306.886.37770737.2080.10-0.381葉綠體Chloroplast25C2444H3824N674O739S26

表3 馬鈴薯StBSKs氨基酸組成比例

Table 3 Proportions of amino acid composition of StBSKs inSolanumtuberosum

%

2.2.2 馬鈴薯StBSKs蛋白結構域與氨基酸序列

保守結構域和序列比對結果表明，StBSKs蛋白為RLCK-Ⅻ類超家族，均含有典型的N端激酶結構域PKc(putative kinase catalytic)、C端三羧氨酸重復TPR(tetratricopeptide repeats)結構域，StBSKs成員間N端存在較大差異。7個StBSKs蛋白成員間的氨基酸序列相似性達到75.89%，成員間兩兩互相比對，相似性在55.49%～87.27%，其中，StBSK3和StBSK4氨基酸序列的相似性最高(87.27%)(圖3)。

2.2.3 馬鈴薯StBSKs蛋白系統進化樹

StBSKs的氨基酸序列與辣椒(Capsicumannuum)、芝麻(Sesamumindicum)、中?？Х?Coffeacanephora)、黃燈籠辣椒(Capsicumchinense)、漿果狀辣椒(Capsicumbaccatum)、木犀欖(Oleaeuropaeavar.Sylvestris)、番茄(Solanumlycopersicum)等多種植物的BSK蛋白氨基酸序列一致性高達90%以上，與中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.Chinensis)、木薯(Manihotesculenta)、毛果楊(Populustrichocarpa)等植物的BSK氨基酸一致性達80%以上。13種不同植物與馬鈴薯StBSKs蛋白的系統進化樹分析結果表明，StBSKs大致可分為2大分支，馬鈴薯StBSK1、StBSK2被聚在第一大分支，其中，StBSK1、StBSK2分別與同為茄科的辣椒、野生煙草(Nicotianaattenuata)聚在2個小分支，這一分支還包括了同為大戟科的木薯(Manihotesculenta)和橡膠樹(Heveabrasiliensis)；馬鈴薯StBSK3和StBSK4與同為茄科的黃燈籠辣椒聚在一個小分支，StBSK5和StBSK6與同為茄科的漿果狀辣椒聚在一個小分支，StBSK7與同為茄科的番茄聚在一個小分支，他們共同聚在第二大分支。表明，同科物種間的BSK親緣關系更近，其中，StBSK3和StBSK4、StBSK5和StBSK6關系最近(圖4)。

3 結論與討論

油菜素內酯是一種類似動物甾醇類激素的植物激素，廣泛存在于各種植物的不同器官，具有調控植物生長發育、增強作物抗逆性的生物學功能。在BR的信號通路中，BSK是一個重要的信號轉導激酶，將BR信號傳導到下游。本試驗首次分離了馬鈴薯StBSK基因家族的7個成員。氨基酸序列比對和系統進化樹結果表明，7個馬鈴薯StBSK成員均與茄科的物種聚為同支，說明BSK在進化過程中與同科物種間的親緣關系較近。StBSKs基因含有典型的保守結構域PKc、三羧氨酸重復結構域，PKc位點在氨基酸序列73～307，三羧氨酸重復結構域位點在390～489，這2個保守域分別在細胞分裂、增殖、凋亡、分化過程中發揮作用，還能介導蛋白與蛋白間的互作[18]。7個馬鈴薯StBSKs氨基酸序列存在一定差異性，且N端保守性較差。StBSKs氨基酸序列富含絲氨酸和蘇氨酸，含少量的酸性氨基酸，這與轉運肽的性質相符。亞細胞定位分析表明，這些馬鈴薯StBSKs蛋白可能主要位于細胞質、細胞核、葉綠體和線粒體，因此推測這些StBSKs蛋白的轉運肽類型可能不同。

圖3 馬鈴薯StBSKs氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of StBSKs in Solanum tuberosum

圖4 馬鈴薯和其他植物的StBSKs蛋白系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of StBSKs in Solanum tuberosum and other plants

BSK基因家族成員在不同植物中的數目和功能存在異同。擬南芥中有12個BSK基因，玉米中有14個BSK基因，玉米中ZmBSK1蛋白可能在質膜系統中起感應與傳導信號的作用；ZmBSK5可能與AtBSK3、AtBSK4、AtBSK6、AtBSK7、AtBSK8功能相似，能夠引起植物表型變化；ZmBSK9可能與AtBSK1作用相同，均能結合受體BRI1，調節玉米的BR信號轉導途徑等；ZmBSK2.1與AtBSK1同源，其可能參與免疫反應(PAMP-triggered Immunity， PTI)的調節[19]。綜上，推測StBSKs基因在馬鈴薯生長發育過程與抗逆境脅迫中發揮重要調控作用，還參與BR信號的感應和傳導作用。