雙靶向紫杉醇聚酰胺聚合物膠束的體內評價

王 瑩，王彥會，劉月平，姜 琳

(吉林省肝膽病醫院，吉林 長春130051)

紫杉醇(PTX)可以作用于細胞分裂過程中組成紡錘體的微管蛋白的特定部位從而起到防止其解聚的作用，在細胞分裂過程中，不能由微管蛋白迅速合成紡錘體微管，使細胞的分裂永遠停留在G2和M期，導致其無法復制，從而起到殺死癌細胞的作用[1-5]。而PTX的溶解性問題是其制劑的首要問題[6]。另外，PTX作為細胞毒性的抗腫瘤藥物，因為缺乏腫瘤靶向性，甚至導致全身性毒性[7]，特別是中性粒細胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應用受到很大限制。我們在前期研究中已制備出以聚酰胺聚合物 (PAMAM)-聚乙二醇(PEG)為骨架的葉酸(FA)/透明質酸(HA)雙靶向載PTX膠束，載藥量為18.5%，本研究利用此類自制的膠束，考察其在小鼠的瘤內分布及抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 十八胺、N,N一二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N一二環己基碳二亞胺、FA、HA、1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺均購自麥克林；硼酸購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；十水合四硼酸鈉、二甲亞砜均購自國藥集團化學試劑有限公司；NH2-PEG2000-COOH、透析袋均購自北京索萊寶科技有限公司；PAMAM購自威海晨源分子新材料有限公司。SKOV-3 細胞株及B16細胞株購自南昌樂悠生物科技有限公司；PTX購自大連美侖生物技術有限公司。

1.1.2儀器 H-J磁力加熱攪拌器(鞏義市裕華儀器有限責任公司)，PH400基礎型酸度計(安萊利斯有限公司)，TY96-11IV超聲波細胞粉碎機(寧波新藝生物科技葛粉有限公司)，高速冷凍離心機(Thermo)，電熱鼓風干燥箱(上海博迅有限公司)，GOLD-SIM冷凍干燥機(美國金西盟國際集團)，小動物活體成像儀capliper(lumina series)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1熒光標記的載PTX膠束的制備 利用PAMAM的氨基末端與異硫氰酸熒光素的異硫氰基可以共價結合的化學反應，制備熒光標記物。稱取PAMAM適量，溶于PBS緩沖液中(pH=7.4)，緩慢滴加異硫氰酸熒光素的丙酮溶液。摩爾比為PAMAM:異硫氰酸熒光素=1∶1.2。避光磁力攪拌36 h，透析袋中透析3 d，離心除去未反應的異硫氰酸熒光素，凍干得到異硫氰酸熒光素標記的PAMAN聚合物。異硫氰酸熒光素，在488 nm激發波長下，顯示特征綠色熒光。稱取硼砂1.8953 g、硼酸 1.2357 g 溶于1 L蒸餾水中，得到pH=8的緩沖溶液，避光保存。將PAMAM 2.0796 g和PEG 0.1410 g溶于20 mL硼砂-硼酸緩沖液中，室溫，避光，磁力攪拌12 h。將反應混合物轉移至50 Kd截留分子量的超濾管中超濾，轉速為4000 rpm/min，30 min/次，共超濾7次，收集上層液體，凍干后稱重、密封保存。按參考文獻的方法合成HA-C18[8]，并進一步合成FA-HA-C18[9]，凍干后稱重、密封保存。稱取PTX 50 mg，溶于2.5 ml無水乙醇中，用無水乙醇溶解的PTX緩慢滴加至FA-HA-C18的溶液中，磁力攪拌24 h，冰浴超聲10 min，溶液于4000 rpm/min離心30 min，上清液經過0.45 μm濾膜，得到FA-HA-PTX混合物。在上述混合液中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應12 h，加至PEG-PAMAM的水溶液中。用鹽酸調節PH值至8.0，室溫避光反應12 h。反應結束后，用蒸餾水透析，離心除雜質，凍干后稱重、密封保存。

1.2.2建立SKOV-3荷瘤裸鼠模型及小動物活體成像檢測 取處于對數生長期的SKOV-3細胞5×106個，接種至5-6周的雌性荷瘤裸鼠的右側腋下，待腫瘤體積長至1 cm3時分為三組，經尾靜脈注射進行給藥，第一組為對照組，給予生理鹽水溶液，第二組為給藥組，給予熒光標記的載PTX膠束(紫杉醇3 mg/kg)。分別于注射后0.5 h，2 h，6 h，12 h，24 h乙醚麻醉小鼠，進行小動物活體熒光成像實驗，記錄腫瘤部位的熒光強度。小動物活體成像儀測定載PTX膠束的熒光(綠光)。

1.2.3建立B16荷瘤小鼠模型及抑瘤率、生存情況的評價 取處于對數生長期的B16細胞1×106個，接種至6-8周的雄性C57BL/6小鼠的右側腋下，待腫瘤體積長至1 cm3時分為三組，經尾靜脈注射進行給藥，第一組為對照組，給予生理鹽水溶液，第二組為陽性組，給予小分子PTX 3 mg/kg，第三組為給藥組，給予載PTX膠束(紫杉醇3 mg/kg)，分別于接種后1 d、7 d、14 d和21 d經尾靜脈注射，每天觀察小鼠的生存狀況，并隔天記錄腫瘤大小，按如下公式計算腫瘤體積、抑瘤率、繪制生存曲線，計算平均生存時間和生存延長期。腫瘤體積：V=a×b2/2(a 長徑，b 短徑)。抑瘤率(%)=(1-D/S)×100 (D，治療組腫瘤體積；S，生理鹽水組腫瘤體積)。生存期延長率(%)=(T/C-1)×100(T，治療組的平均生存時間，C，對照組的平均生存時間)。

2 結果

2.1 腫瘤的熒光成像

如圖1所示，隨著時間的延長，熒光標記載PTX膠束的腫瘤部位熒光蓄積逐漸增多，均顯著高于對照組，尤其在12 h時及24 h時最多，說明熒光標記載PTX膠束的腫瘤靶向性較好。

圖1 腫瘤內熒光成像(對照組：給予生理鹽水溶液；給藥組：給予熒光標記的載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

2.2 腫瘤的抑瘤效果及小鼠生長情況

如圖2所示，載PTX膠束(給藥組)的抑瘤效果與小分子PTX(陽性組)類似，隨著時間的延長，給藥組和陽性組腫瘤的體積逐漸降低，從接種20 d開始，給藥組腫瘤體積較陽性組略有降低，說明載PTX膠束的抑瘤效果明顯，且略強于小分子PTX。

圖2 各組小鼠的腫瘤生長情況(對照組：給予生理鹽水溶液；陽性組：給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組：給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

如圖3所示，載PTX膠束組小鼠的平均生存時間隨著時間的延長無明顯變化，陽性組和對照組小鼠的平均生存時間逐漸降低，陽性組小鼠的平均生存時間顯著長于對照組，說明載PTX膠束組小鼠的平均生存時間明顯長于對照組和小分子PTX組。

圖3 各組小鼠的平均生存時間(對照組：給予生理鹽水溶液；陽性組：給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組：給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

如表1所示，載PTX膠束組小鼠的抑瘤率顯著強于對照組，略強于陽性組；載PTX膠束組小鼠的平均生存時間顯著長于對照組及陽性組；載PTX膠束組小鼠的生長期延長率顯著高于對照組及陽性組。

表1 各組小鼠的抑瘤率、平均生長時間及生長期延長率統計結果

注：對照組給予生理鹽水溶液；陽性組給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg。

3 討論

惡性腫瘤已經成為影響人類健康的主要疾病之一，據統計，2010年有超過1200萬人被確診患上癌癥，有760萬病人死于各種癌癥。我國流行病學調查顯示，惡性腫瘤的死亡率居城市和農村全部死亡病例之首，并有明顯上升趨勢。如今，惡性腫瘤的治療方法中，化療是主要方法之一[10-13]，但化療藥物又存在缺乏靶向性和毒副作用大的缺陷。所以設計構建毒副作用小，靶向性高的抗腫瘤靶向載體系統具有很好的藥學研究前景。

分子物質和脂質在腫瘤組織透過性增強及滯留效應稱作實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR)[14,15]，EPR效應促進了大分子類物質在腫瘤組織的選擇性分布,可以增加藥效并減少系統副作用，本研究基于EPR效應原理，將高分子聚合物與小分子化療藥物的偶聯物，通過藥劑學手段結合到高分子材料表面，有效地緩解了傳統納米粒的突釋效應，因而具有獨特的優勢。并且通過雙靶向載藥系統設計進一步提高PTX抗腫瘤作用，并改善其毒副作用。本研究中采用了FA和HA作為腫瘤靶向基團，對PTX-PAMAM進行了雙靶向的修飾，并組裝成膠束進行了體內評價。

體內評價首先采用了半定量的小動物活體成像實驗，初步考察了載PTX膠束在SKOV-3荷瘤裸鼠腫瘤部位的蓄積，結果表明，隨著時間的延長，熒光標記載PTX膠束的腫瘤部位熒光蓄積逐漸增多，均顯著高于對照組，尤其在12 h時及24 h時最多，說明熒光標記載PTX膠束的腫瘤靶向性較好。其次，采用B16荷瘤小鼠的體內抗腫瘤活性研究，通過腫瘤生長曲線、小鼠生存曲線及抑瘤率等觀察，均可看出載PTX膠束組在小鼠的抑瘤率、生存時間、生存率等方面均顯示出明顯的優勢。由此可見，將高分子聚合物與小分子化療藥物PTX偶聯，并以雙主動靶向基團修飾載體后組裝成納米膠束，在體內抑瘤效果及腫瘤靶向標記等方面均是一種可行的途徑，但其作用機制有待進一步研究。