關于醫學病原腸道傷寒桿菌毒性實驗方法的改進

于 軍,賀 丹,張 靈,李洪巖

(吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

病原微生物學是基礎醫學中最重要的一門課程，也是比較特殊的一門醫學基礎課程。病原微生物學實驗教學，也是當今最受重視的一門教學。在醫學病原微生物實驗教學中，尤其病原腸道致病菌：傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌的生化鑒定的實驗教學，衛生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》，將傷寒桿菌、痢疾桿菌病原微生物列為第二類病原微生物，屬高致病性病原微生物。根據《名錄的規定》，在實驗室操作中，腸道致病菌等應在BSL-2或在ABSL-2實驗室進行[1-3]。

目前在國外世界衛生組織(WHO為了指導實驗室生物安全，減少實驗室事故的發生，與1983年出版了《實驗室生物安全手冊》、各國各部門對生物安全要求都是硬性規定[4]。美國在1974年出版了《微生物和生物醫學實驗室生物安全手冊》首次提出了四級病原微生物危害和四級實驗室活動的概念，主要涉及職業衛生、生物安保、風險評估、部分農業病原體、生物毒素等新內容[5]。

我國發布的《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗室活動生物安全審批管理辦法》(衛生部第50號令)中也強調：從事高致病性病原微生物實驗活動資格必須經過審批，三、四級生物安全實驗室從事高致病性病原微生物實驗活動，必須取得衛生部頒發的《高致病性病原微生物實驗室資格證書》[6-8]。

為了做好病原微生物學腸道桿菌的實驗教學，對病原微生物學腸道傷寒桿菌的減毒株的實驗研究迫在眉睫。

項目起源于醫學病原微生物學臨床五年制教學大綱,項目名稱為病原性腸道桿菌的分離鑒定(712045).現改革其實驗方法[9-12]。

1 材料與方法

1.1 傷寒桿菌臨床分離株、傷寒桿菌減毒株

傷寒桿菌臨床分離株(TH))由吉林大學基礎醫學院病原生物學系提供，(均為患者首次入院首次分離株)，傷寒桿菌減毒株(TY21a)、(PQ)由生物制品所提供。上述菌株經法國梅里埃公司VITEK-32 微生物分析鑒定系統鑒定，由吉林大學基礎醫學院病原生物學系實驗室保存。質控菌株： 大腸埃希菌JM101，為基礎醫學院病原生物學系實驗室保存。

1.2 主要試劑

(1)培養基：S-S培養基(Salmonella-Shigella Agar；產品編號：HB4089;青島高科園海博生物技術有限公司生產；克氏雙塘培養基(Kligler Iron Agar)：產品編號：HB6234;青島高科園海博生物技術有限公司生產；半固體培養基(Semisolid Agar)；產品編號：HB4168-3;青島高科園海博生物技術有限公司生產)；LB營養瓊脂培養基(LB Nutrient Agar,產品編號：HB0129;青島高科園海博生物技術有限公司生產；LB肉湯培養基(LB Broth),產品編號：HB0128;青島高科園海博生物技術有限公司生產；腸道編碼生化鑒定管：杭州天和公司。

(2)其他：瓊脂糖(上海生工生產)；PEG 8000(Merck公司生產)；

1.3 主要儀器和設備

臺式離心機(上海安享科學儀器廠)；電子天平(JD400-3型：沈陽龍騰儀器有限公司)；恒溫培養振蕩器(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫培養箱(DHP-9162，中儀國科(北京)科技有限公司)；恒溫孵育搖床,ES-60杭州米歐儀器有限公司。

微波爐(WD800AS-4，格蘭仕公司生產)；潔凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司)；透射電鏡(HITACHI H-7650：日本株式會社日立電器有限公司生產)；醫用低溫冰箱(MDF-U300，日本松下公司)；生物顯微鏡(E100型，日本尼康公司)；制冰機(北京長流科技有限公司生產)。

2 方法

2.1 傷寒桿菌

傷寒減毒株的復蘇及培養 (傷寒株—TH;傷寒減毒株：TY21a) 、(PQ)。

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種LB肉湯培養基于恒溫震蕩搖床過夜培養，24 h后取出，于LB瓊脂平板上分離劃，培養8-12 h(37℃)。注意觀察細菌生長狀態，培養完成后挑單菌落進行接種，接種S-S培養基(Salmonella-Shigella Agar)，通常接種病原性腸道桿菌都選用鑒別培養基。因為S-S培養基成分中含有乳糖、中性紅指示劑及抑制非腸道致病菌生長的抑制劑。大腸埃希菌分解乳糖產酸，指示劑顯示成紅色。傷寒桿菌臨床分離株及傷寒減毒株不分解乳糖，生成透明菌落。有些腸道桿菌長生硫化氫，故有黑色生成。

圖1 傷寒減毒株PQ及TY21a 的對比性培養實驗

圖2 傷寒減毒株PQ及TY21a 與原傷寒臨床分離株TH

2.2 接種克氏雙糖培養基

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種克氏雙糖培養基(Kligler Iron Agar)，37度24 h培養。圖2鐵雙塘培養基斜面含乳糖、產酸時候酚紅指示劑變黃，上層含有枸櫞酸銨鐵，故可看產生H2S,底部黑色及有無鞭毛。

2.3 傷寒桿菌及傷寒減毒株半固體培養基(Semisolid Agar)

用于觀察腸道菌的動力培養基。

半固體培養基可以觀察動力。產氣時培養基有氣泡或崩開，可以觀察傷寒桿菌動力。

表1 鐵雙塘培養傷寒桿菌及傷寒減毒株鑒定對比實驗

2.4 腸道編碼生化鑒定

2.5 腸道因子血清學鑒定對比試驗

沙門菌屬應用已知的抗血清測定菌株的抗原成分，用已知的血清抗體與未知的腸道桿菌(抗原)進行玻片凝集試驗，定屬、定群、定種。通過細菌的培養特性及生化反映可以初步鑒定病原性腸道桿菌，只有通過血清學鑒定才能最后確定檢測細菌的屬、群、種。

表2 傷寒桿菌及傷寒減毒株生化鑒定對比

+為產酸產氣注：糖發酵試驗中，-為不發酵，+為產酸產氣

圖3 傷寒桿菌(TH)及傷寒減毒株(PQ)編碼鑒定對比

①沙門氏菌屬多價抗“O”血清

②沙門氏菌屬組抗“O”因子血清

③型抗“H”因子血清

方法：取一接種環診斷血清放于載玻片上，再從鐵雙塘培養基上取少許培養物充分研磨混勻，同時生理鹽水作對照。

結果：對照均勻渾濁。培養物與診斷血清室溫數分鐘后肉眼可見顆粒狀凝集，為陽性。經過對比，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽性。

圖4 大腸埃希菌及編碼鑒定對照

圖5 傷寒桿菌(TH)及減毒株(TY21a)因子血清學鑒定

3 結果

實驗結果：S-S培養基傷寒桿菌及傷寒減毒株均生長，革蘭染色為革蘭陰性菌；鐵雙塘培養基均生長傷寒桿菌及傷寒減毒株；有H2S產生、有動力。血清學鑒定：診斷血清室溫數分鐘后肉眼可見顆粒狀凝集，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽性。由此得出結論：醫學生病原微生物學實驗課中腸道致病性桿菌的傷寒桿菌，可以用傷寒減毒株(Ty21a)或(PQ)取代[10，11]。這樣既可以保持病原微生物學實驗課學生的生物安全，醫學生可以學習到腸道致病菌的一系列生化特性，掌握全面的致病性腸道桿菌的生物學特性，又可以避免臨床分離株對師生造成感染。達到了基礎醫學病原微生物學實驗課程的安全性、系統性、完整性[12，13]。