BRAFV600E免疫組化在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及與臨床病理特征的相關性研究

周 迪，劉 霞，丁國楠*，姜 瑛，馬 麗

(1.吉林大學第二醫院 甲狀腺外科，吉林 長春130041; 2.青島市市南區八大湖街道巢湖社區 衛生服務中心，山東 青島266000)

近年來，甲狀腺癌的發病率逐年升高，超聲及影像學技術的廣泛應用和細針抽吸活檢的普及是導致這一發病率上升的部分原因。其中甲狀腺乳頭狀癌約占甲狀腺癌的85%[1]，是最常見的內分泌腫瘤，腺葉切除術或甲狀腺全切除術加I131治療是常規的治療方式，但大約10%的PTC患者存在復發、淋巴結或遠處轉移，因此需要進一步干預。BRAF基因突變是近年來PTC診斷的主要發展方向。人們對BRAF基因突變認識的深入得益于聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Sanger測序等基因檢測技術、免疫組織化學(IHC)檢測技術的不斷提高。其對于甲狀腺癌，尤其是在提高PTC的診斷率，實施個體化治療，評估PTC的發生、發展和不良臨床病理特征相關性方面尤為重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院2017年8月-2018年3月間收治的154例甲狀腺腫物患者，所有患者均具備手術指征，給予甲狀腺全切/次全切除術、頸部中央區淋巴結清掃術。甲狀腺乳頭狀癌患者89例，結節性甲狀腺腫患者40例，橋本氏甲狀腺炎患者25例。其中89例甲狀腺癌患者中男性為20例、女性為69例，男女比例為1:3，年齡在19歲-67歲，平均年齡43歲。

1.2 主要試劑及檢測方法

1.2.1主要試劑 所用鼠抗人CK19、Galectin-3、HBME-1單克隆抗體(即用型)以及BRAF基因突變檢測試劑盒(Ventana免疫組化增強擴增試劑盒)。美國 ventanae Bnch Mark ⑧x T 全自動免疫組化染色儀。

1.2.2免疫組織化學法檢測 標本均經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片(3 μm)及常規的 HE染色。利用美國 ventanae Bnch Mark ⑧x T 全自動免疫組化染色儀及Ventana免疫組化增強擴增試劑盒，對 CK19、Galectin-3、HBME-1進行免疫標記，檢測154名甲狀腺腫物患者的CK19、Galectin-3、HBME-1蛋白表達水平。具體的實驗步驟按照操作步驟說明書進行，經過一系列的抗原修復、顯色、染色操作后，用中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察實驗切片的染色情況。

1.2.3PCR法及DNA測序法檢測 分別檢測89例甲狀腺乳頭狀癌患者、40例結節性甲狀腺腫患者、25例橋本氏甲狀腺炎患者BRAFV600E基因基因突變。選擇各組患者手術標本組織的HE切片，連續切4 μm厚白片，封存于EP管，二甲苯處理，蛋白酶K完全消化，嚴格依照DNA提取試劑盒說明書提取石蠟組織標本DNA。應用BRAF基因突變檢測試劑盒在自動化基因分析儀進行測序。采用電腦軟件分析測序結果。

1.3 統計學分析所有數據整理后采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同甲狀腺腫瘤組織中BRAFV600E、CK19、HBME-1、G-3的表達

89例甲狀腺乳頭狀癌中基因突變率為78.61%(70/89)，CK19在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本氏甲狀腺炎中表達率分別91.01%(81/89)、17.50%(7/40)、12.00%(3/25)，HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本氏甲狀腺炎中表達率分別為75.28%(67/89)、12.50%(5/40)、16.00%(4/25),Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本氏甲狀腺炎中表達率分別為87.64%(78/89)、15.00%(6/40)、20.00%(5/25)。由此可見，BRAFV600E、CK19、HBME-1、Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌中表達率明顯高于結節性甲狀腺腫、橋本氏甲狀腺炎，結果見表1。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與臨床病理特征的關系

通過對比甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與患者的性別、年齡、病灶直徑、是否侵犯被膜、有無頸部中央區淋巴結轉移、單灶或多灶病理學特征，發現甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與是否侵犯被膜存在相關性(χ2=6.701，P<0.01)，而與性別、年齡、病灶直徑、有無頸部中央區淋巴結轉移、單灶或多灶無明顯相關性(P>0.05)，結果見表2。

表2 89例甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與臨床病理特征的關系

3 討論

BRAF基因突變是甲狀腺癌中最常見的致癌突變[2]。BRAF是RAF家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶。RAF蛋白是RAF-MEK-ERK途徑[絲裂原活化蛋白(MAP)/細胞外信號調節激酶(ERK)]的一部分，是真核生物中高度保守信號轉導通路。RAS是RAF的上游激活蛋白，通過與GTP結合而呈活化狀態，進而激活RAF蛋白，使MEK磷酸化并激活ERK[3]。而BRAFV600E指第15號外顯子第1799位(T1799A)的核苷酸發生胸腺嘧啶到腺嘌呤的轉換，導致在殘基600位(V600E)上谷氨酸取代了原本的纈氨酸，甲狀腺癌中BRAF突變大于92%是該種類型[4]。研究表明BRAFV600E基因突變絕大多數見于甲狀腺乳頭狀癌[5]，其在甲狀腺良性病變中僅少量表達或不表達，當然不同研究的略微差異可能與地域、及樣本量有關。在本研究中發現BRAFV600E在甲狀腺乳頭狀癌中表達率明顯高于結節性甲狀腺腫及橋本氏甲狀腺炎。得益于BRAFV600E基因突變在甲狀腺乳頭狀癌中較高的檢出率，越來越多的國內外專家推薦甲狀腺超聲引導下穿刺細胞學檢查聯合BRAFV600E基因突變檢測。相關研究也表明結果診斷率高達90%[6]。

此外BRAF基因突變影響細胞增殖、抑制分化和凋亡。換句話說，BRAF基因突變突變細胞失去正常細胞周期，從而引發惡性腫瘤的發生發展。因此在PTC中，BRAF基因突變被認為是腫瘤復發和預后差的危險因素，并且與腫瘤發病機制相關[7]。

CK19是一種低分子量的細胞角蛋白，是上皮細胞中的一種中間絲蛋白，廣泛存在于單純性和復雜性上皮細胞以及某些癌組織中。Song Q等人在研究中發現CK19在甲狀腺乳頭狀癌中高表達，而在良性病變中不表達，因此指出CK19對甲狀腺乳頭狀癌的診斷有很高價值[8]。在Lamba Saini M的研究中，CK19在甲狀腺乳頭狀癌中的表達率為84-100%，甲狀腺微小乳頭狀癌為59-84%，結節性甲狀腺腫為26.8%，橋本氏病為20%[9]。本研究中CK19在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎中表達率分別91.01%(81/89)、17.50%(7/40)、12.00%(3/25)，同樣表明其在甲狀腺乳頭狀癌中的表達率明顯高于另外兩種良性病變。

HBME-1 為酸性氨基酸多聚糖蛋白， 是間皮細胞表面微絨毛的一種抗原成分。Prasad 等通過204例甲狀腺病理組織分析得出HBME-1的表達對于鑒別高分化甲狀腺癌與甲狀腺良性腫瘤意義重大[10]。近年來國內相關研究也得出同樣結論，研究指出HBME-1 在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達率為92.5%，在良性病變中幾乎不表達[11]。本研究中HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎中表達率分別為75.28%(67/89)、12.50%(5/40)、16.00%(4/25)。綜合諸多研究可見HBME-1主要表達于甲狀腺惡性腫瘤，在甲狀腺良性腫瘤中僅少量表達。

Galectin-3 是一種β-半乳糖苷結合凝集素，在甲狀腺癌等多種腫瘤的轉移、血管生成、增殖和凋亡中發揮作用[12]。通過與特異性配體結合，調控甲狀腺癌細胞的增殖、凋亡、粘附、浸潤、轉移等生物學行為。相關研究表明， Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達率為64.9-100%，在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達率為45.7-98.0%，在結節性甲狀腺腫中的表達率為0-52.6%，在橋本氏病中的表達率為19.0-38.9%[9]。在本研究中Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌、結節性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎中表達率分別為87.64%(78/89)、15.00%(6/40)、20.00%(5/25)。

由于CK19、HBME-1及Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌中的高表達率，已成為一組甲狀腺乳頭狀癌免疫組化檢測的重要指標。結合免疫組化檢測及基因突變檢測，對于提高PTC 的診斷率意義重大。Qiu等人將免疫組化與RT-PCR和Sanger測序進行了比較[13]。Jung等人將免疫組化與RT-PCR和BRAF RNA原位雜交進行比較[14]。結合兩組研究看出，BRAFV600E免疫組化的靈敏度和特異性范圍分別為89%-100%和61%-100%。此外國內最新研究通過對62例甲狀腺癌患者組織和62例甲狀腺良性病變組織的免疫組化結果及BRAFV600E突變情況結合分析指出甲狀腺乳頭狀癌相關免疫組化表達與BRAFV600E突變呈明顯正相關[15]。但CK 19、HBME-1及Galectin-3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征相關性研究較少，仍需大量臨床資料歸納總結。

國內外大量研究資料均指出BRAFV600E基因檢測在提高甲狀腺超聲引導下細針穿刺細胞學檢查準確率方面的積極作用。同時結合本研究及國內外相關研究也發現BRAFV600E基因檢測聯合某些蛋白免疫組化檢查對于提高甲狀腺乳頭狀癌的診斷意義重大。

此外甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與其臨床特征的相關性也是國內外眾多學者關注的方向。通過分析BRAFV600E基因突變和臨床病理特征之間的關聯我們發現，BRAFV600E基因突變與患者的年齡和性別無關。Wang等人的大規模meta-analysis 分析也表明BRAFV600E基因突變與患者的年齡和性別無相關性[16]。本研究中發現甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E基因突變與被膜浸潤有關，差異有統計學意義(P<0.05)。與性別、年齡、腫瘤直徑、頸部中央區淋巴結轉移、癌灶數量無關(P>0.05)。但也有相關國內外文獻指出BRAFV600E突變與較高的病理學分期、淋巴浸潤、神經浸潤、腫瘤包膜缺失、甲狀腺外擴散和甲狀腺內擴散有關。Frasca 等人通過對甲狀腺癌高危因素的分析，指出BRAFV600E基因突變仍然是影響腫瘤腺外侵及、淋巴結轉移和較高病理分期的獨立因素。BRAFV600E突變與預后不良的關系在Kim TH、Liu X等人的不同Meta分析也給予相似的結論[16]，說明BRAFV600E基因突變的PTC更易呈多灶性表現，更易發生甲狀腺腺外浸潤和淋巴結轉移，具有較高的臨床分期。但也有相關的研究給出了不同的結論，這可能于實驗技術、醫療水平等因素有關。Pelttari等人發現[17]隨著隨訪時間的延長，BRAFV600E突變與淋巴結轉移和/或復發無關。Nam JK等人的研究也指出BRAFV600E突變與PMCs復發無關[18]。Zheng等人研究發現BRAFV600E突變與淋巴結轉移無明顯相關性[19]。

盡管BARFV600E基因突變作為PTC預后獨立危險因素存在爭議，但其仍考慮是甲狀腺乳頭狀癌發生、發展以及影響預后的因素之一。實際的臨床工作中，對于甲狀腺乳頭狀癌患者，也應綜合評估其流行病學特征，臨床病理學特征以及遺傳改變，綜合評估預后，給予更精確的個性化治療。