miR-29c在慢性腎臟病患者血清中的表達及臨床意義研究

謝媚媚 潘敏 龔裕強

慢性腎臟病（CKD）是一種病因復雜的的進行性疾病，是導致慢性腎衰竭的主要病因。腎間質纖維化(RIF)是CKD進展到慢性腎衰竭過程中腎臟組織發生的主要病理改變。miRNA是一類約18～24個核苷酸長度的非編碼單鏈小分子RNA，可與靶基因配對引起其降解，或者抑制其翻譯，進行轉錄后調控[1]。筆者團隊前期研究發現，miR-29c在大鼠單側輸尿管梗阻模型腎組織中表達下調，可能參與RIF的發生、發展[2]。miRNA在血清中相對穩定，且具有抗酸、抗堿、抗凍融處理、抗RNA酶的特性[3]，血液樣本容易獲取，這為研究miRNA在血清中的表達提供了可行性。基于此，本研究采用實時熒光定量PCR法檢測miR-29c在CKD患者中的表達情況，分析其與RIF的關系，探討miR-29c作為診斷RIF的生物標志物的可能性，并以期為臨床治療RIF提供新的靶點，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年5月至2018年9月本院收治的CKD患者135例為CKD組，其中男71例，女64例；年齡 18～65（40.9±4.8）歲；BMI 18.5～25.8（21.9±2.4）；均符合K/DOQI指南中CKD的診斷標準[4]，其中慢性腎小球腎炎78例，糖尿病腎病25例，高血壓腎病24例，多囊腎8例；均經腎穿刺活檢明確有不同程度的RIF，所有患者均未開始行透析治療（包括血液透析和腹膜透析）；排除紅斑狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙肝相關性腎炎等繼發性病變以及遺傳性腎小球腎炎、腎小管間質病變，排除合并心肺疾病、腎功能突發進行性惡化患者。另擇同期健康體檢無腎臟疾病者135例為正常對照組，其中男 70 例，女 65 例；年齡 19～64（41.2±5.1）歲；BMI 18.6～26.1（21.7±2.1）；均無糖尿病、高血壓等基礎疾病。兩組受檢者性別、年齡、BMI等一般資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，研究對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green I熒光定量試劑盒購于日本TOYOBO公司；實時熒光定量PCR引物由上海Invitrogen公司設計并提供；低速臺式離心機購于上海安亭儀器廠；超低溫冰箱購于美國Thermo公司；PCR儀購于德國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 血清肌酐、胱抑素C水平檢測 抽取兩組受檢者清晨空腹靜脈血10ml，室溫下靜置1～2h，低速離心分離（室溫下3 000r/min離心10min），冰上取上清液，部分上清液分裝于EP管中，-80℃保存用于提取RNA，另一部分上清液用于檢測血清肌酐、胱抑素C。血清胱抑素C檢測采用膠乳增強免疫比濁法，試劑盒由金華市強盛生物科技有限公司生產。血清胱抑素C、血肌酐使用西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀進行測定。

1.2.2.2 腎臟病理學檢查 CKD組患者入院后均首次在B超引導下行經皮腎活檢穿刺術，取新鮮腎臟活檢標本進行Masson染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理圖片判斷RIF的嚴重程度。RIF指數評估方法：每例標本在光學顯微鏡下（×200）隨機選取10個不重復的腎皮質區進行拍照，采用IPP 6.0圖像分析軟件計算每個視野小管間質纖維化面積與同視野小管間質總面積的百分比；0分，無損傷，≤5%；1分，輕度損傷，6%～25%；2分，中度損傷，26%～50%；3分，重度損傷，＞50%[5]。10個視野取平均分為RIF指數。

1.2.2.3 miR-29c、膠原Ⅰ（ColⅠ）mRNA水平檢測 ColⅠ基因是miR-29c的靶基因之一，ColⅠ是細胞外基質（ECM）的主要組成成份。采用Trizol法提取兩組受檢者血清總RNA，按照勻漿、兩相分離、沉淀、清洗、溶解沉淀步驟進行，提取的RNA置于-80℃超低溫冰箱中保存。用紫外分光光度法確定RNA濃度及鑒定純度。在普通PCR儀進行逆轉錄反應合成cDNA。反應體系20μl，包括總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆轉錄酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反應條件：16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，結束后反應產物于-20℃保存。使用SYBR Green法，反應體系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、逆轉錄產物 1μl、plus solution 2μl、SYBR GreenⅠMaster mix 10μl、雙蒸水加至 20μl。反應條件為 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min（ColⅠmRNA 為 58 ℃ 1min），進行40個循環反應，所有樣品均做3個復孔[2]。應用實時定量 PCR儀進行PCR反應，用2-ΔΔCt法計算相對定量，miR-29c的內參為U6，ColⅠmRNA的內參為GAPDH，ΔΔCt=[Ct目的基因（CKD組）-Ct內參（CKD組）] -[Ct目的基因（正常對照組）-Ct內參（正常對照組）] ，正常對照組的ΔΔCt為0，因此以2-ΔΔCt表示CKD組相對于正常對照組的表達水平。

1.3 觀察指標 觀察并比較兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達水平；分析CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA之間的關系。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson相關；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達水平比較 CKD組患者血清肌酐、胱抑素C水平均高于正常對照組（均P＜0.05），血清miR-29c表達水平低于正常對照組（P＜0.05），ColⅠmRNA表達水平高于正常對照組（P＜0.05），見表1。

2.2 CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關性分析CKD組患者RIF指數為（2.39±0.77）分。CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數、血清肌酐水平、血清胱抑素C水平、ColⅠmRNA表達水平均呈負相關（均P＜0.05），見表 2。

表2 CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關性分析

3 討論

CKD已成為全球公共健康問題，成人CKD全球患病率約為10%～13%[6]。RIF是各種原因導致的CKD進展為終末期腎衰竭的共同途徑[7]，因ECM產生與降解失衡，導致ECM在腎間質過度沉積，包括ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ和纖連蛋白等。miRNA參與細胞凋亡、增殖、分化及炎癥、免疫反應等生理病理過程[8]。miRNA與器官纖維化密切相關，miR-29c在大鼠單側輸尿管梗阻模型腎組織中以及轉分化后的大鼠腎間質成纖維細胞中表達下調，可能參與RIF的發生、發展過程[2，9]。本研究CKD組患者均經腎臟穿刺活檢明確有不同程度的RIF，與正常對照組相比，血清miR-29c表達明顯下調，提示miR-29c表達下調可能與RIF有關。

ColⅠ在人肝癌（HepG2）體外細胞株中證實是miR-29c的靶基因[1]。本研究結果顯示，CKD組患者血清miR-29c表達明顯下調，ColⅠmRNA表達明顯上升，兩者呈負相關，這說明miR-29c負向調控ColⅠ。miR-29c的靶基因包括 ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ、原纖維蛋白、層粘連蛋白、血管內皮生長因子A等[10-11]，大部分編碼ECM，血管內皮生長因子A促進ECM在內皮細胞外堆積。在CKD患者中，血清miR-29c表達明顯下調，可能通過以上靶基因使ECM生成增多并促進ECM堆積而參與RIF，且miR-29c與RIF指數呈負相關，說明miR-29c可能是RIF發生、發展中的一個重要參與因子。

腎臟疾病的預后與RIF程度密切相關。腎臟穿刺活檢行病理學檢查能夠直接反應腎組織的病理特點，目前仍是檢測RIF的主要手段。但腎臟穿刺活檢具有一定危險性，術后存在出血、繼發感染等風險，且需重復活檢了解病情進展以及評估治療效果。miRNA在血液循環、尿液或其他體液中能夠穩定存在，不易降解，被認為是最有潛力的疾病生物標志物，可反映某些疾病病變及病情嚴重程度。本研究結果表明CKD患者血清miR-29c表達水平隨著RIF的加重而下降，提示miR-29c的表達水平可作為評價RIF嚴重程度的指標。實時熒光定量PCR檢測血清中miRNA表達水平已經是一項成熟技術，因此，檢測CKD患者血清miR-29c表達水平可作為診斷RIF以及隨訪的檢查指標。

血清肌酐是最常用來評價腎功能的指標，血清胱抑素C作為內源性標志物，與腎小球濾過率相關性最好，其主要由腎小球濾過率決定，不受性別、肌肉容積、炎癥、腫瘤影響，是反映腎功能的敏感指標[12]。本研究中CKD組患者血清miR-29c表達水平與血清肌酐、血清胱抑素C水平均呈負相關，提示miR-29c的表達水平可作為評價腎功能的輔助指標。

已有研究發現，將人工合成的miR-29c mimics轉染大鼠腎間質成纖維細胞上調miR-29c，可抑制ColⅠ表達起到抗纖維化作用[9]。本研究在CKD患者中證實miR-29c負向調控ColⅠ，這為今后治療RIF提供了新的方向。

綜上所述，本研究結果顯示，CKD患者血清miR-29c表達明顯下調，miR-29c可能通過相應靶基因使ECM生成增多，并促進ECM堆積而參與RIF。血清miR-29c表達水平可作為診斷RIF以及隨訪的生物標志物，且可作為評價腎功能的輔助指標，其抗纖維化作用為臨床治療RIF提供了新的方向。