中期因子在絨毛膜癌中的表達及其與臨床病理特征的關系研究

姚紅麗 姚英武 崔開宇 李娟 仝進毅 孫麗萍

中期因子（midkine，MK）屬于肝素結合因子的一種多肽，在人體胚胎發育期與細胞生長、分化有關。MK在胚胎時期高表達，出生后逐漸降低，在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外，其他部位幾乎不表達[1]。研究發現，MK在多種人類腫瘤中過度表達，在腫瘤發生、發展的過程中發揮重要作用，具有促進細胞生長、遷移、浸潤、分化及抗細胞凋亡等作用[1-3]，并且與腫瘤的不良預后有關[4-5]。MK在絨毛膜癌（以下簡稱絨癌）中的表達情況及其與絨癌的轉移、侵襲、預后的關系研究報道不多。本研究旨在分析MK在絨癌中的表達情況，探討MK表達與絨癌病理特征的關系，以期為絨癌的診治及預后判斷提供理論參考，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人絨癌細胞株JEG-3由中國科學院北京細胞所細胞庫提供，人絨癌細胞株JAR由中國科學院上海生物細胞研究所提供。

1.1.2 組織標本 選取2012年1月至2017年12月在本院行手術治療32例絨癌患者的絨癌組織標本，患者年齡 27～55（39.6±7.2）歲；其中腫瘤臨床分期Ⅰ期 12例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。絨癌組織標本均為患者手術切除的子宮組織標本。患者臨床資料完整，術前均未接受過化療。

1.1.3 主要試劑和儀器 Transwell侵襲小室購自美國Corning Costar公司。Matrigel體外侵襲試驗凝膠購自北京大學細胞生物學系。RPMI 1640培養基購自美國GibcoBRL 公司，PBS緩沖液（pH 7.2～7.6）購自美國 Sigma公司。免疫組織化學S-P試劑盒、兔抗人MK多克隆抗體、Western blot、增強化學發光法（ECL）檢測試劑盒購自武漢博士德公司。兔抗人β-actin抗體及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。逆轉錄試劑盒購自北京嘉美生物科技有限公司。Forma 3111型水套式二氧化碳培養箱為美國Forma公司產品。常、低溫超速離心機為德國Eppendorf公司產品。iQ5實時熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人絨癌細胞株JEG-3、JAR的培養 將JEG-3、JAR細胞株接種于RPMI 1640培養液中，EG-3、JAR細胞均呈貼壁生長，JEG-3細胞形態不規則。JEG-3、JAR細胞株均生長良好，3d傳代1次。接種后的細胞在培養液中呈現懸浮狀態，細胞質回縮，細胞呈圓球形，大約4h后細胞在培養瓶底部附著，貼壁生長，隨即細胞進入對數生長期。細胞長滿瓶壁后，進入平臺期，此時細胞雖然有活力但不再分裂。選擇對數生長期的JEG-3、JAR細胞進行后續實驗。

1.2.2 絨癌JEG-3、JAR細胞體外侵襲能力檢測 采用Matrigel法。取對數生長期的JEG-3、JAR細胞，采用Transwell侵襲小室檢測系統，檢測400倍光鏡下的穿膜細胞數，觀察四周和中間的5個不同視野，取其平均數值。JEG-3、JAR細胞在體外的侵襲能力以穿膜細胞數量來表示。實驗重復5次。

1.2.3 不同培養時間點絨癌JEG-3、JAR細胞MK mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法分別檢測JEG-3、JAR細胞培養12、24、48h時MK mRNA表達水平。參照RT-PCR逆轉錄試劑盒的說明書進行操作，分別提取JEG-3、JAR細胞的總RNA 2μl，多聚胸腺嘧啶T重復寡核苷酸 Oligo（dT）15μl和適量雙蒸水（ddH2O）水混勻至總體積 13μl，70℃變性 5min，冰上放置 5min，再加入5×逆轉錄緩沖液 5μl、dNTP 混合物 1μl、RNA 酶抑制劑1μl，MMV 逆轉錄酶 1μl，ddH2O 4μl，至總體積為 25μl，混勻，42℃孵育60min，85℃滅活5min，冰上驟冷。再取40個 EP管，每管分別裝入 RT產物 1.5μl，Taqmix 12.5μl，ddH2O 9μl，SYBR Green 1μl，擴增的目的基因引物各1μl，采用實時熒光定量PCR法擴增。MK上游引物：5′-AGCAAAGGCCAAAGCCAAGA-3′，下游引物：5′-ACAAGGCAGGGCATGATTGA-3′。GAPDH 上游引物：5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′，下游引物：5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′。反應條件設為95℃預變性 3min，95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 50s，40個循環。實驗重復5次。

1.2.4 絨癌JEG-3、JAR細胞MK蛋白表達水平檢測采用Western blot法。分別提取JEG-3、JAR細胞的總蛋白，蛋白含量采用Bradford法檢測。每條泳道置入50μg的總蛋白，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳完成后轉膜及封閉，然后加入兔抗人MK一抗或β-actin抗體，4℃孵育過夜，用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（TBS）洗膜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔 IgG（1∶2 000），室溫條件下孵育1h，TBS洗膜3次，按ECL顯色試劑盒進行顯色、曝光、沖洗X線片。Western blot檢測結果掃描后應用Gel-pro Analysis圖像分析處理軟件進行圖像吸光度值分析。實驗重復5次。

1.2.5 絨癌組織MK蛋白表達情況檢測 采用免疫組織化學法。將用石蠟包埋的絨癌組織標本均連續4μm厚切片，采用S-P法進行免疫組織化學顯色反應，MK抗體的工作濃度為1∶150。用已知的MK和Ki-67陽性片作為陽性對照；0.01%mol/L PBS代替一抗，其余操作同正常免疫組化染色步驟，作為陰性對照。MK蛋白表達陽性細胞為細胞質和（或）細胞膜中出現黃色、棕褐色顆粒。每張切片觀測10個具有代表性的高倍視野，每個高倍視野記數50個細胞，依據鏡下陽性細胞占細胞總數的百分率綜合判斷。MK蛋白表達陽性細胞數＜10%為陰性（-），10%～20%為弱陽性（+），21%～50%為中等陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。

1.3 觀察指標 （1）比較絨癌JEG-3、JAR細胞體外侵襲能力；（2）比較不同培養時間點絨癌JEG-3、JAR細胞MK mRNA表達水平；（3）比較絨癌JEG-3、JAR細胞MK蛋白表達水平；（4）分析絨癌組織MK蛋白陽性表達率與臨床病理特征的關系，包括患者年齡、腫瘤臨床分期、國際婦產科聯盟（FIGO）預后評分等。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用Fisher確切概率法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絨癌JEG-3、JAR細胞體外侵襲能力比較 JEG-3細胞的穿膜細胞數為（204.5±12.5）個/視野，JAR 細胞的穿膜細胞數為（136.4±17.6）個/視野，JEG-3細胞穿膜數明顯多于JAR細胞，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05），即JEG-3細胞體外侵襲能力強于JAR細胞，見圖1。

圖1 絨癌JEG-3、JAR細胞穿膜情況比較（×400）

2.2 絨癌JEG-3、JAR細胞MK mRNA表達水平比較培養12、24、48h時，高侵襲性JEG-3細胞MK mRNA表達水平均高于低侵襲性JAR細胞，兩者比較差異均有統計學差異（均P＜0.05），見圖2。

圖2 不同培養時間點絨癌JEG-3、JAR細胞MK mRNA表達水平比較

2.3 絨癌JEG-3、JAR細胞MK蛋白表達水平比較MK蛋白在高侵襲性JEG-3細胞中的表達水平為（1.87±0.20），在低侵襲性JAR細胞中的表達水平為（0.70±0.19）。JEG-3細胞MK蛋白表達水平高于JAR細胞，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 絨癌JEG-3、JAR細胞MK蛋白表達電泳圖

圖4 絨癌JEG-3、JAR細胞MK蛋白表達水平比較

2.4 絨癌組織MK蛋白表達情況與臨床病理特征的關系分析 分析絨癌組織MK蛋白表達情況與患者年齡、臨床分期、FIGO預后評分的關系，結果顯示MK蛋白在絨癌組織中的表達陽性率與患者年齡無明顯關系，在＜40歲與≥40歲患者間的差異無統計學意義（P＞0.05），MK蛋白在臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的絨癌組織中表達陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期的絨癌組織（P＜0.05），在FIGO預后評分高危的絨癌組織中表達陽性率高于低危的絨癌組織（P＜0.05），見表 1。

3 討論

MK存在于細胞的表面和細胞外基質中，它對葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度親和力。妊娠中期可見MK大量表達，表明MK蛋白在妊娠的過程中起重要作用[6]。在成人身上，MK被限制在一定的組織中表達。然而，在腫瘤發生、炎癥和組織細胞修復過程中，MK的表達明顯上調。MK在多種人類惡性腫瘤中均高度表達，如頭頸部腫瘤、消化道腫瘤、泌尿系統腫瘤等[7-9]，且MK可能參與腫瘤發生、發展、轉移等過程，并與不良預后有關[10-11]。本研究結果也發現MK在絨癌高侵襲性JEG-3細胞、低侵襲性JAR細胞及絨癌組織中均有不同程度表達，提示MK可能與絨癌的侵襲性改變有關。

表1 絨癌組織MK蛋白表達情況與臨床病理特征的關系分析

Huang等[12]采用免疫組織化學和RT-PCR技術對胃癌組織進行檢測，發現MK表達水平與腫瘤臨床分期及遠處轉移呈有關，表明MK對腫瘤轉移有促進作用。Ma等[13]發現MK表達陽性可獨立預測肝膽管細胞癌復發，發現MK表達陽性預示可切除的肝膽管細胞癌患者預后不良。Xia等[14]表明MK在非小細胞肺癌中表達水平越高，癌細胞的侵襲、轉移能力越強，提示預后不良。Taku等[15]采用Cox比例風險模型對頭頸部鱗狀細胞癌的研究發現，血清MK水平為患者生存的獨立預后因子，過表達會導致患者死亡的相對風險上升，且血清MK水平與化療敏感性有關。本研究結果也顯示MK蛋白在絨癌組織中的表達與臨床分期及FIGO預后評分有關，臨床分期越晚、FIGO預后評分高危的絨癌組織MK蛋白表達明顯增強，提示MK與絨癌侵襲及預后相關。

絨癌屬于妊娠滋養細胞腫瘤的一種，是源于胎盤滋養細胞的惡性疾病。因此，研究MK在絨癌中的表達情況意義重大，可能通過干預MK基因在絨癌中的表達，從而干預絨癌細胞的侵襲和轉移，達到改善患者預后的目的。為研究MK高度表達與絨癌侵襲、轉移的相關性，本研究小組前期研究發現絨癌組織中MK的表達明顯強于侵蝕性葡萄胎及葡萄胎組織，提示MK可能是促進絨癌細胞侵襲、轉移的一個重要因素，其表達水平升高可能增強絨癌細胞的侵襲能力[16]。為進一步研究MK高度表達與絨癌侵襲、轉移及預后的關系，本研究采用Matrigel體外侵襲試驗、Western blot法、RT-PCR從蛋白及mRNA水平對MK在絨癌組織及細胞株中進行了檢測。發現隨著絨癌臨床分期的升高MK的表達明顯增強；而且高侵襲性JEG-3細胞中MK的表達水平明顯高于低侵襲性JAR細胞。這表明絨癌組織中MK的表達增強可能是促進絨癌細胞侵襲、轉移的一個重要因素，同時也影響了絨癌患者的預后。但其具體分子作用機制有待進一步深入研究。Lu等[8]研究膽管癌細胞系對吉西他濱化療耐藥機制，發現MK促進膽管癌細胞的上皮細胞向間充質轉化（EMT），當EMT被小干擾（si）RNA靶向Twist阻斷時，MK對吉西他濱耐藥的增強作用被消除。此外，MK促進了Notch-1的表達，而siRNA敲低Notch-1則阻斷了膽管癌細胞系的EMT過程。這說明MK通過上調Notch-1誘導EMT促進膽管癌的吉西他濱耐藥，促進腫瘤復發轉移。此外，對皮膚黑色素瘤的研究表明，MK是決定患者預后的新淋巴管生成的系統誘導物，MK的這一作用與淋巴內皮細胞中mTOR通路的旁分泌激活有關[17]。

綜上所述，MK在絨癌組織中高表達，且與絨癌細胞侵襲能力有關，其表達陽性率隨絨癌分期的升高而增高。MK在絨癌的侵襲、進展中起至關重要的作用，可作為判斷絨癌惡性程度和預后的重要生物標志物。